Em primeiro lugar, agradecemos sinceramente as mães que participaram deste projeto. Em seguida, reconhecemos todo o pessoal que auxiliou e facilitou o procedimento de amostragem, o Anestesista, o enfermeiro anestesista e os enfermeiros cirúrgicos. O projeto não teria sido possível sem o financiamento da Autoridade Regional de Saúde do Sudeste da Noruega e da Unidade Norueguesa de Assessoria em Saúde da Mulher, Universidade de Oslo e financiamento local fornecido pelo Hospital Universitário de Oslo.

O estudo foi aprovado pelos funcionários de proteção de dados do Hospital Universitário de Oslo e do Comitê Regional de Ética em Pesquisa Médica e de Saúde, no sul da Noruega 2419/2011. Todos os participantes assinaram um consentimento informado e esclarecido na inclusão. 1. Preparações NOTA: Uma linha de tempo para os procedimentos está descrita na Figura 1 . <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> Figura 1 : Diagrama de fluxo descrevendo o tempo e o pessoal envolvido no procedimento de amostragem de 4 embarcações. Uma cor representa uma pessoa. A descrição detalhada do método é dada no protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Funcionários <ol><lI&gt; Certifique-se de que todos os funcionários necessários estão disponíveis: um especialista em medicina fetal altamente qualificado que realiza as medidas de ultra-som, dois obstetras que realizam a cirurgia, um dos obstetras e duas enfermeiras que coletam as amostras, um assistente que administra as análises de gases sangüíneos e um assistente que administra a Outras amostras de forma consecutiva e imediatamente após a coleta. NOTA: Nos casos de coleção mais avançada de tecido placentário, é necessária uma pessoa adicional. </li></ol></li><li> Equipamento <ol><li> Prepare o equipamento, 50 mL de solução salina tamponada com fosfato 1 M (PBS), 25 mL de solução estabilizadora de ARN frio e 5 x 0,5 mL de composto de temperatura de corte ideal (OCT). Rotule os aspiradores e tubos. Consulte a lista provisória de equipamentos. </li></ol></li></ol> 2. Características maternas <ol><li> Registre as características clínicas e não clínicas maternas na inclusão e repita as questões relevantes e euAsurações, incluindo peso, no momento da entrega. Registre a duração do período de jejum antes da cesariana e quaisquer episódios hipotensivos que ocorram durante a cirurgia. Nota: Inclua o conjunto de dados clínicos materno mínimo relatado em uma publicação recente do Laboratório Global de Gravidez (COLAB). Este artigo também inclui alguns aspectos muito importantes na escolha das populações estudadas e deve ser abordado ao planejar o estudo 18 . </li><li> Considere registrar características paternas, incluindo etnia, idade e índice de massa corporal (IMC). </li></ol> 3. Ultrassom <ol><li> Execute o exame de ultra-som Doppler no dia da entrega, com as mulheres em estado de jejum. Realizar o exame durante um período de quiescência fetal, com a mulher em posição semi-supina, inclinada ligeiramente lateralmente oposta à região de interesse, a fim de evitar a compressão da aorta e veia cava. Monitorar a saída emTensão pelos índices mecânico e térmico na tela. </li><li> Veia umbilical <ol><li> Visualize a veia umbilical em uma transição sagital ou oblíqua do abdômen fetal. Meça o diâmetro interno do vaso na porção reta da veia umbilical intra-abdominal, antes de qualquer ramo visível. Use o modo B regular e visualize o vaso em um ângulo de insônia perpendicular para medições de diâmetro e mantenha vários quadros ótimos para medições posteriores para minimizar o efeito de mudanças de diâmetro pulsátil. <ol><li> Repita as medidas de cinco a dez vezes 19 . </li></ol></li><li> No mesmo local, use o ultra-som Doppler e ajuste a sonda para obter um ângulo de insonção tão baixo quanto possível (sempre &lt;30 °) para medir a velocidade máxima calculada no tempo (TAMX). Obtenha a velocidade durante um período de 3 a 5 s (fluxo não pulsante). </li></ol></li><li> Artéria uterina <ol><li> Use DopplerUltra-som para visualizar a artéria uterina à medida que atravessa a artéria ilíaca externa, imediatamente depois dele se ramifica da artéria ilíaca interna. Ajuste a sonda neste site para obter um ângulo de insonação baixo (sempre &lt;30 °) e medir TAMX. Obtenha a velocidade como a velocidade média de três ciclos de coração. </li><li> Como é improvável que tenha um ângulo perpendicular no mesmo local que o TAMX é medido, siga o vaso distalmente para obter um ângulo correto para medições de diâmetro tão próximas dos locais de medidas de diâmetro quanto possível. Exclua as medidas do diâmetro se qualquer vaso visível se afastar antes deste site, conforme avaliado pelo ultra-som Doppler colorido. <ol><li> Use o modo B regular e visualize o vaso em um ângulo de insônia perpendicular para medições de diâmetro e mantenha vários quadros ótimos para medições posteriores para minimizar o efeito de mudanças de diâmetro pulsátil. </li><li> Repita as medidas de cinco a dez vezes 19 . </li></ol></<html> Li&gt; </ol></li><li> Observe a posição da placenta. </li></ol> 4. Amostragem de sangue de 4 vasos NOTA: A linha de tempo para os procedimentos está descrita na Figura 1 e uma visão geral das amostras é ilustrada na Figura 2 . <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> Figura 2 : Ilustração esquemática da Vasculatura Placentária e dos Sites de Amostragem. No método de amostragem de 4 embarcações amostras de sangue são extraídas da veia uterina, a artéria radial (como um proxy para a artéria uterina) e as artérias e veias umbilicais. O fluxo sanguíneo na artéria uterina e a veia umbilical são medidos por ultra-som. As amostras de tecido da placenta são coletadas. Ilustração: Øystein H. Horgmo, Universidade de Oslo.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <ol><li> Procedimentos de segurança <ol><li> Forneça todo o pessoal na operação teatro com luvas, roupas cirúrgicas, máscaras e maquiagem. </li><li> Fornecer aos cirurgiões e ao pessoal de pesquisa em contato com o campo de operação com trajes, máscaras, chapelaria, vestidos e luvas duplas cirúrgicas. Os óculos são opcionais. </li><li> Forneça pessoal que manipule as amostras de sangue com luvas. </li><li> Forneça pessoal que manipule as amostras de placenta com luvas e máscara cirúrgica. A homogeneização requer o uso de capuzes. </li></ol></li><li> Preparação no teatro de operações <ol><li> Dê um briefing e entregue o equipamento a todo o pessoal que ajudará a amostragem antes do início da cirurgia. </li><li> Dirija-se ao enfermeiro de anestesiologista e anestesiologista que irá auxiliar no acesso arterial e venoso periférico necessário e assegurará queNenhum líquido é administrado por via intravenosa antes da amostragem. </li><li> Dê três seringas (10 mL) sem agulhas para a pessoa que assiste com a amostra de veia antecubital e duas seringas (uma 20 mL e uma 10 mL) e uma seringa de sangue (com heparina) para a pessoa que auxilia na artéria radial. </li><li> Prepare duas seringas estéreis (20 mL), cinco seringas estéreis (10 mL), três &quot;agulhas de borboleta&quot; e duas seringas de gás de sangue para o campo de operação. </li></ol></li><li> Acesso a vasos sanguíneos. <ol><li> Siga o procedimento padrão antes da cesariana para assegurar o acesso periférico intravenoso (iv). NOTA: A veia antecubital é preferível porque é mais fácil extrair amostras deste site. </li><li> Localize a artéria radial no pulso por ultra-som ou por palpação. Após 0,5 mL de analgesia subcutânea de lidocaína, coloque uma linha arterial na artéria radial. Abandone a amostragem deste site em caso de três inserções com falha, ouSe a mulher experimentar dor durante a inserção. NOTA: Realize o procedimento cirúrgico da cesariana de acordo com o procedimento padrão. Somente os ajustes necessários para o processo de amostragem são sublinhados abaixo. </li></ol></li><li> Amostras de sangue materno NOTA: Obtenha as três amostras de sangue materno (veia uterina, artéria radial e veia antecubital) simultaneamente antes da incisão uterina. <ol><li> Para a veia uterina, depois de abrir a cavidade abdominal, use um retractor para levantar a parede abdominal e exponha os ramos principais das veias uterinas nos lados ântero-laterais do útero. Obtenha sangue dos ramos da veia uterina no mesmo lado da placenta sempre que possível ou use o plexo da veia mais proeminente se a placenta estiver localizada na linha média uterina. <ol><li> Insira uma agulha de borboleta em uma seringa de gás no sangue na veia uterina com um ângulo de aproximadamente 30 graus e coleça o sangue através de uma aspiração suave para evitarHemólise. Ao assegurar cuidadosamente a posição iv da agulha de borboleta, substitua a seringa de gás cheia de sangue por uma seringa de 20 mL e 10 mL consecutivamente. NOTA: O melhor acesso é melhor assegurado quando se posiciona no lado contralateral da veia uterina escolhida. </li></ol></li><li> Para a artéria radial, aspirar da linha intra-arterial. Descarte os primeiros 5 mL e, em seguida, aspirar 3 mL em seringa de heparina para análises de gases no sangue, seguido de 3 mL em duas seringas (20 + 10 mL). </li><li> Para a veia antecubital, aspirar gentilmente do cateter intravenoso. Descarte os primeiros 5 mL, e depois aspirar 30 mL em três seringas (10 mL). </li><li> Realize uma inspeção final do local de amostragem na veia uterina antes de começar a fechar o abdômen. </li></ol></li><li> Amostras de sangue fetal <ol><li> Quando a criança nasce, imediatamente aspirar sangue da artéria umbilical, sem apertar o cordão umbilical ou entregar a placenta. Comece o conhecimentoH, a seringa para análises de gases sanguíneos, e siga com três seringas de 10 mL, se possível. </li><li> Quando as amostras arteriais estiverem seguras, prenda o cordão e entregue a criança à parteira antes da amostragem da veia umbilical (gás de sangue e 20 + 10 mL de seringas). NOTA: Obtenha todas as amostras umbilicais dentro de segundos do parto e com a placenta in situ, a menos que tenha desprendido espontaneamente. </li><li> Siga as recomendações norueguesas sobre o aperto do cordão tardio. Em caso de criança com dificuldades, abrace e corte o cordão imediatamente e entregue a criança à parteira e ao neonatologista. </li></ol></li><li> Manuseio de amostras de sangue <ol><li> Coloque as seringas de sangue no gelo enquanto prepara o resto das amostras de sangue e analise-as em um analisador de gases no sangue dentro de 5 min. </li><li> Transfira as amostras de sangue imediatamente para vacutainers e coloque os tubos de plasma em um balancim por 1 a 2 minutos antes de colocá-los no gelo. Deixe os tubos de soro no trabalhoBanco de torres para se instalar por 30 minutos. NOTA: Este é um passo crítico no procedimento que precisa de atenção extra porque amostras de todos os cinco sites devem ser preparadas simultaneamente para garantir boa qualidade. </li><li> Centrifugar as amostras de plasma o mais rápido possível e dentro de 30 min, a 6 ° C, 2.500 xg por 20 min. </li><li> Após 30 min, centrifugar as amostras de soro à temperatura ambiente durante 10 min a 2.500 x g. </li><li> Alíquota os sobrenadantes cuidadosamente para 2 mL de tubos de cryo, deixando 0,5 mL do sobrenadante acima do grânulo para garantir plasma livre de plaquetas. </li><li> Armazene as amostras a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Coleção de tecido placentário <ol><li> Coloque a placenta plana na bandeja de dissecação gelada o mais rápido possível após a entrega. Fotografar e medir o diâmetro mais longo e o diâmetro a 90 graus. </li><li> Pesar a placenta. </li><li> Registre o peso, os dois diâmetros, qualquer gPatologia ross, número de vasos no cordão e o intervalo de tempo desde a entrega até quando a placenta foi colocada no gelo. NOTA: envie a placenta para o exame patológico se for clinicamente indicado. </li><li> Coloque a placenta com a superfície materna voltada para cima e identifique 4 a 5 locais de amostragem localizados aleatoriamente em cada quadrante da placenta, evitando áreas de patologia franca. Remova a decidua usando uma tesoura para cortar 3 a 5 mm da superfície materna. Colecione um tecido vilão de 1 a 2 cm 3 de cada local. </li><li> Lave o tecido recolhido suavemente em 50 mL de PBS 1M frio. Divida em várias peças de cada local de amostragem e uma alíquota. Nota: O tamanho das peças da placenta dependerá das análises planejadas. </li><li> Adicione alíquotas de amostras de tecido de 0,1 - 0,5 cm 3 a 5 tubos de cryo e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. </li><li> Adicione pequenos pedaços de 0,1 - 0,2 cm 3 ao tubo com 25 mL de solução de estabilização de ARN. Loja às 46; C por 24 h, descarte a solução de estabilização de ARN e substitua-a. Congelar. </li><li> Adicione pedaços de 0,5 cm 3 aos 5 tubos cryo com 0,5 mL de OCT, adicione-os com OCT, misture e congelem. </li><li> Armazene as amostras a -80 ° C até a análise. NOTA: Burton et al. Fornece uma excelente visão geral dos aspectos práticos da amostragem da placenta de acordo com as análises planejadas. 20 Considere preparar o tecido remanescente para o isolamento das membranas microvilas e basais e coletar o tecido decidual por técnica de sucção de vácuo. 21 , 22 </li></ol> 6. Características neonatais <ol><li> Registre as características neonatais, incluindo Apgar-score (1, 5 e 10 min), sexo, peso, comprimento, idade gestacional e admissão na Unidade de Terapia Intensiva do Recém-Nascido (comprimento e resultado da estadia). </li><li> Considere medir a composição do corpo neonatal por medidas antropométricas, deslocar o arPletismografia ou dupla absorciometria de raios-X. 23 , 24 </li></ol> 7. Cálculos <ol><li> Assuma composição sanguínea semelhante na artéria radial e uterina e calcula a diferença de concentração arteriovenosa uteroplacentária. Diferença de concentração arteriovenosa uteroplacentária = C A - C V Diferença de concentração venosa-arterial umbilical - arterial = C v -C a Onde C é concentração com subscritos: A, a artéria radial; V, a veia uterina; V a veia umbilical e a, a artéria umbilical. </li><li> Calcule o fluxo sanguíneo do volume, mL / min (Q): <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Onde D é o diâmetro do vaso (cm), TAMX é a velocidade máxima calculada no tempo e h é o coeficiente para o perfil espacial da velocidade do sangue. Use 0.5 como o coeficiente para a veia umbilical e0,6 para a artéria uterina 25 , 26 . </li><li> Calcule a aceitação e liberação da placenta de acordo com o princípio de Fick: Captação uteroplacental = ( C A - C V ) x Qm Captação fetal = ( C v - C a ) X Q f Subscritos: m, materno e f, fetal. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+mTORC1+signaling+in+placental+nutrient-sensing.">The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing.</a> Placenta. 33, 23-29 (2012).</li><li>Cetin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+transport+of+amino+acids+in+normal+and+growth-restricted+pregnancies.">Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, 50-54 (2003).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

<html> O método de amostragem de 4 vasos da placenta é relevante para três propósitos principais. Primeiro, pode ser usado para estudar como substâncias específicas são absorvidas pela placenta do lado materno e, possivelmente, transferidas para a circulação umbilical e para o feto, conforme demonstrado pelos estudos de glicose e aminoácidos. Em segundo lugar, o método é altamente relevante para estudar substâncias produzidas pela placenta e liberadas para a circulação materna ou fetal, conforme demonstrad...

De acordo com o National Institutes of Health, EUA, a placenta é o órgão menos entendido no corpo humano 1 , 2 , 3 . É difícil acessar e estudar a placenta humana in vivo sem impor riscos éticos na gravidez em curso. Os estudos da função placentária no ser humano são, portanto, amplamente baseados em modelos in vitro e ex vivo . A maioria dos estudos anteriores in vivo de transporte placentário e metabolismo foram realizados em animais 4 , 5 , 6 . No entanto, como a estrutura e as funções da placenta variam consideravelmente entre as espécies, a extrapolação dos resultados dos animais aos humanos deve ser feita com cautela. Apenas alguns estudos humanos menores in vivo investigaram a absorção placentária e fetal e o transporte sob condições fisiológicas normais.Todas as condições, e nenhuma explorou a transferência integrada de vários compostos 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Esses estudos fundamentais ilustram que os estudos in vivo da placenta humana são viáveis ​​e que podem servir para vários propósitos. Em primeiro lugar, os conceitos atuais de funções placentárias derivadas principalmente de estudos in vitro , ex vivo e em animais podem ser testados em um ambiente humano e, portanto, fornecem uma visão nova e mais específica da placenta humana. Em segundo lugar, as propriedades da placenta disfuncional associada ao crescimento fetal aberrante, pré-eclâmpsia, diabetes materna, síndrome metabólica e outros distúrbios metabólicos maternos podem ser melhor caracterizados. Em terceiro lugar, os estudos humanos in vivo proporcionam uma oportunidade para desenvolver o diagnósticoFerramentas tic e preditivas de função placentária. Neste contexto, buscamos estabelecer uma coleção abrangente de dados fisiológicos para investigar a função placentária humana in vivo. Durante uma cesariana planejada, exploramos o acesso intraabdominal à veia uterina para coletar amostras de sangue dos vasos entrantes e salientes nos lados materno e fetal da placenta (o método de amostragem de 4 vasos). Essas amostras são usadas para calcular as diferenças de concentração arteriovenosa pareadas de nutrientes e outras substâncias 14 . Além disso, medimos o fluxo sangüíneo de volume em ambos os lados da placenta por ultra-som. Conseqüentemente, a captação placentária e fetal de qualquer composto pode ser quantificada. Além disso, é possível determinar as substâncias liberadas pela placenta para as circulações materna e fetal 15 , 16 , 17 . Quando combinarD com parâmetros clínicos de mãe e filho e análises de tecidos placentários e outros tecidos relevantes, este método tem o potencial emocionante para integrar muitos aspectos das funções placentárias in vivo nos mesmos pares mãe-feto.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Maternal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impedance scale</td><td>Tanita</td><td></td><td>or similar</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ultrasound measurements&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512 ultrasound machine</td><td>Acuson</td><td></td><td>equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Blood samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arerial cannula</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>or similar</td></tr><tr><td>20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>or similar. 3 needed.</td></tr><tr><td>10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>or similar. 9 needed.</td></tr><tr><td>5 cc 6% Luer Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>or similar. 2 needed.</td></tr><tr><td>Arterial blood gas syringe&amp;nbsp;</td><td>Radiometer Medical</td><td></td><td>or similar. 4 needed.</td></tr><tr><td>Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>(intended for single use).3 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL EDTA&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>or similar. Label with sample site. 10 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 3 mL&amp;nbsp; 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.</td></tr><tr><td>Marked trays to transport the syringes</td><td></td><td></td><td>to transport the blood samples in the operation theatre</td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td>for gentle mixing of the samples</td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Placenta samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal ruler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>or similar. Dilute 10 M to&amp;nbsp; 1 M before use</td></tr><tr><td>RNA stabilization solution</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&amp;nbsp;</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>vwr</td><td>361603E</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>or similar. Label with &quot;RNA later&quot;, sample site and ID. 2 needed.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fetal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Measuring tape</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the 4-vessel sampling approach to integrative studies of human placental physiology in vivo

A placenta humana é altamente inacessível à pesquisa enquanto ainda está no útero . A compreensão atual da fisiologia placentária humana in vivo é, portanto, baseada em grande parte em estudos com animais, apesar da alta diversidade entre espécies em anatomia placentária, hemodinâmica e duração da gravidez. A grande maioria dos estudos de placenta humana são estudos de perfusão ex vivo ou estudos de trofoblasto in vitro . Embora os estudos in vitro e os modelos animais sejam essenciais, a extrapolação dos resultados desses estudos para a placenta humana in vivo é incerta. Pretendemos estudar a fisiologia da placenta humana in vivo a termo e apresentar um protocolo detalhado do método. Explorando o acesso intraabdominal à veia uterina imediatamente antes da incisão uterina durante a cesariana planejada, recolhemos amostras de sangue dos vasos entrantes e de saída nos lados materno e fetal da placenta. Ao combinar conMedições de centragem a partir de amostras de sangue com medidas de fluxo sanguíneo volumétrico, podemos quantificar a absorção placentária e fetal e a liberação de qualquer composto. Além disso, amostras de tecido placentário dos mesmos pares mãe-feto podem fornecer medições da densidade e atividade do transportador e outros aspectos das funções placentárias in vivo . Através deste uso integrativo do método de amostragem de 4 embarcações, somos capazes de testar alguns dos conceitos atuais de transferência de nutrientes da placenta e metabolismo in vivo , tanto em gravidezes normais quanto patológicas. Além disso, este método permite a identificação de substâncias segregadas pela placenta para a circulação materna, o que pode ser um importante contributo para a busca de biomarcadores da disfunção placentária.

O método de amostragem de 4 vasos é aplicável na prática clínica e obtivemos amostras de sangue com sucesso de 209 pares de mãe / bebê. Em 128 destes, também conseguimos medir o fluxo sanguíneo do volume. A amostragem completa de 4 vasos e as medidas de fluxo de boa qualidade de vasos maternos e fetais foram obtidas em 70 pares mãe-feto ( Figura 3 ). Além disso, até agora, colhemos amostras de sangue e placenta de 30 pacientes pré-eclâmicos. N?...

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The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Apresentamos um método detalhado para estudar a fisiologia placentária humana in vivo a termo. O método combina a amostragem de sangue dos vasos entrantes e de saída nos lados materno e fetal da placenta com medidas de ultra-som do fluxo sangüíneo do volume e amostragem do tecido placentário.

A abordagem de amostragem de 4 embarcações para estudos integrativos de fisiologia placentária humana<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

the-4-vessel-sampling-approach-to-integrative-studies-human-placental

Research

JoVE Journal

Medicine

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

10.5K visualizações.  Oslo University Hospital.  Apresentamos um método detalhado para estudar a fisiologia placentária humana in vivo a termo. O método combina a amostragem de sangue dos vasos entrantes e de saída nos lados materno e fetal da placenta com medidas de ultra-som do fluxo sangüíneo do volume e amostragem do tecido placentário. 

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Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

Guia de Cateterismo Fio Assistida e injeção de corante colorido para o Mapeamento de Vascular monocoriônicas placentas gêmeas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Medicina

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologia

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Bioengenharia

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Biologia do Desenvolvimento

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Perfusão ex vivo da placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Imunologia e Infecção

Melhorando a cultura de explante placentário ex vivo usando uma abordagem baseada em fluxo

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa por meio de sequenciamento de células únicas e histologia espacial em tecidos placentários 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

A abordagem de amostragem de 4 embarcações para estudos integrativos de fisiologia placentária humana

Resumo

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