Name: modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
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Os autores reconhecem o apoio da unidade compartilhada de Oncologia Biobehavioral do Instituto de Câncer da Universidade de Pittsburgh que é apoiada em parte pelo prêmio P30CA047904.

1. Extração de DNA Genômico <ol><li> Execute uma extração de DNA genômico das células (aqui, linha celular BJ-HTERT) para ser analisado usando um kit comercial de extração de DNA, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Medir a concentração de DNA com um espectrofotômetro. Se a concentração de DNA for inferior a 100 μg / mL, precipite o ADN com etanol e ressuspenda-se num volume de tampão TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM (ácido etilenodiaminotetraacético), pH 8,0), para assegurar uma concentração de ADN de 100-600 μg / mL). </li></ol> 2. Avaliação da Integridade do DNA NOTA: Esta porção do protocolo descreve uma avaliação da integridade do DNA usando um sistema de eletroforese em gel com um gel de 11 cm x 14 cm. Outros sistemas e tamanhos de gel também podem ser usados, mas a tensão e o tempo de migração do DNA podem variar. <ol><li> Prepare um gel de agarose a 1% combinando 1 g de agarose com eletroforese em 100 mL de tampão 1x TAE (Tr. 40 mMÉ base; Ácido acético 20 mM; EDTA 2 mM; PH 8,5) e microondas até que a agarose seja dissolvida e a solução é clara. Arrefecer a solução à temperatura ambiente até atingir 50 ° C (aproximadamente 15-20 min). </li><li> Enquanto a solução de agarose estiver esfriando, prepare a bandeja de fundição de gel, adicionando os portões da extremidade de fundição à bandeja de fundição. Para evitar vazamento de agarose, esfriar os portões de extremidade para 4 ° C antes de se conectar à bandeja de fundição. </li><li> Uma vez que a solução de agarose arrefeceu para 50 ° C, adicione 10 μL de brometo de etídio (10 mg / mL em dH 2 O) e despeje a solução de agarose na bandeja de fundição de gel. Adicione o pente à bandeja de fundição. </li><li> Permitir que a solução de agarose dure por 45 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Prepare amostras de DNA para eletroforese, diluindo 25 ng de DNA genômico usando tampão 1x TE para um volume final de 9 μL e adicione 1 μL de 10 x Colorante de carga (0,25% (p / v) de azul de bromofenol, xileno a 0,25% (p / v) Cianol FF, 30% (v / v) de glicerol). Misture bem. </li><lI&gt; Prepare o sistema de eletroforese em gel para a migração de DNA preenchendo o sistema de eletroforese com 1x tampão TAE de modo que o nível do tampão seja de vários milímetros acima do gel. Carregue os poços do gel com a totalidade das amostras de DNA. Adicione 5 μL de uma escada de DNA a um único poço. </li><li> Execute a migração do DNA a 100 V por aproximadamente 2 h ou até que o corante azul de bromofenol seja aproximadamente a meio do gel. </li><li> Imagem do gel usando um transiluminador de luz ultravioleta ou equivalente. NOTA: amostras de DNA com boa integridade têm bandas de alto peso molecular sem manchas (que é devido ao DNA cortado ou quebrado). Se as bandas de DNA são manchadas, elas têm baixa integridade e não são adequadas para a análise Southern Blot, e o DNA deve ser re-isolado com células novas. </li></ol> 3. Digestão genômica de DNA <ol><li> Execute a digestão do DNA genômico em um volume final de 20-40 μL. NOTA: Volumes maioresQue 40 μL transbordarão os poços do gel de agarose. <ol><li> Combine 3 μg de DNA genômico e a quantidade adequada de 10x tampão de digestão de DNA (fornecido com as enzimas de restrição) para que a concentração final seja 1x, em um microtube. Adicione 1 μL de enzima de restrição RsaI (10 000 U / mL) e 1 μL de enzima de restrição HinfI (10 000 U / mL) a cada tubo. Ajuste o volume final usando H 2 O esterilizado e desionado. Misture bem. Centrifugar brevemente (10 - 15 s a 16,000 xg) para garantir que todos os componentes estejam na parte inferior do tubo. </li></ol></li><li> Incubar as digestões a 37 ° C por ≥16 h. Após a digestão, armazene o DNA digerido a 4 ° C ou -20 ° C por não mais de 2 dias, se necessário 17 . </li></ol> 4. Eletroforese em gel genômico de DNA NOTA: Esta parte do protocolo descreve um procedimento para o uso de um sistema de eletroforese em gel de 20 cm x 25 cm. Electro eletrodo diferenteOs sistemas de phoresis podem ser usados, mas várias variáveis ​​podem precisar ser modificadas, incluindo a tensão, o tempo de migração e a quantidade de tampão de eletroforese adicionado ao sistema para produzir resultados ótimos. <ol><li> Preparar 0,6% de solução de agarose combinando 2,25 g de agarose em grau de eletroforese em gel com 375 mL de tampão de eletroforese, seja 1x TAE ou TBE 0,5x (base de Tris 110 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3). NOTA: Para telômeros inferiores a 8 000 kB, é recomendado 0,5x TBE, enquanto que é recomendado um TAE para telômeros entre 8 000 kB e 20 000 kB 1 . </li><li> Microondas a solução até a dissolução da agarose e a solução é clara. Deixe a solução arrefecer durante 15 a 20 minutos à temperatura ambiente ou até a agarose atingir 50 ° C. </li><li> Enquanto a solução de agarose está arrefecida, prepare o sistema de eletroforese em gel para moldagem em gel como descrito no passo 2.2. Despeje a solução de gel de agarose em uma bandeja de fundição de gel. Coloque um pente naO gel. Deixe o gel endurecer durante 45 minutos descoberto à temperatura ambiente. </li><li> Prepare as amostras de DNA digeridas para eletroforese. Para uma reacção de 40 uL, adicione 0,4 μL de 10 x tintura de carga em cada amostra de ADN digerido. Centrifugue brevemente (10-15 s, 16,000 xg) para garantir que toda a solução esteja na parte inferior do tubo. </li><li> Prepare o sistema de eletroforese em gel para a migração de DNA. Remova os portões de extremidade e pente do gel. Preencha o sistema de eletroforese em gel com 1x TAE ou TBE 0,5x até a linha de enchimento, assegurando que o gel esteja completamente submerso no tampão. </li><li> Carregue os poços do gel com as amostras de DNA, de modo que haja um poço branco entre as amostras. Evite causar bolhas ou perfurar o gel. Adicione 10 μL de uma escada de DNA em poços nas extremidades opostas do gel. NOTA: O tipo de escada de DNA dependerá do comprimento dos telômeros, que variará de pessoa para pessoa e entre fontes celulares. </li><li> Execute a eletroforese em gel em 150 V por 30 minutos para mover rapidamente o DNA para o gel; Depois ajuste a tensão para 57 V e corra durante 18-24 h. </li></ol> 5. Gel de imagem fluorescente e hibridação <ol><li> Após 18-24 h, desligue a fonte de energia de eletroforese em gel. Retire a bandeja de fundição de gel com o gel do tampão de eletroforese. Corte o canto superior direito do gel para servir como referência para a orientação do gel. </li><li> Prepare um pedaço de papel de filtro cortando o papel para ser um tamanho um pouco maior do que o gel. Coloque o papel de filtro em cima do gel na bandeja de vazamento e permita que o papel absorva o excesso de solução no gel. Retire cuidadosamente as bolhas de ar entre o papel de filtro e o gel usando uma pipeta como um rolo para espremer as bolhas através dos lados. </li><li> Retire o gel da bandeja de fundição, deslizando o gel e filtre o papel para que o papel fique por baixo do gel. Transfira o gel com o papel de filtro para um secador de gel e cubra oGel com plástico. Remova todas as bolhas de ar entre a película plástica e o gel usando uma pipeta como rolo. </li><li> Secar o gel durante 2 h a 50 ° C. </li><li> Uma vez seco, retire a embalagem de plástico e transfira o gel e filtre o papel para um prato de vidro contendo 250 mL de água desionizada (suficiente para cobrir o gel). Remova cuidadosamente o papel de filtro e incube o gel à temperatura ambiente durante 15 min. O gel será fino, firme e fácil de manipular sem rasgar. </li><li> Preparar 5x SSC solução (750 mM NaCl; 75 mM citrato de sódio) em água desionizada. </li><li> Coloque o gel sobre uma malha de nylon (12 in x 12 in). Enrole a malha de nylon e o gel em conjunto, certificando-se de que o gel não esteja em contato consigo mesmo. Coloque a malha e o gel em um tubo de hibridação ( por exemplo , 12 em tubo com 1,5 de diâmetro). NOTA: Quando devidamente enrolado, o gel estará em contato com a malha de nylon em ambos os lados. </li><li> Combine 100 mL de 5x SSC e 12 μL de nucleido fluorescente verde aCid mancha, e coloque no tubo de hibridação. Proteja a solução da luz e incube durante 30 min a 42 ° C num forno de hibridação com rotação. </li><li> Remova a malha / gel de nylon do tubo de hibridação, role-a e coloque-a em um prato de vidro contendo 250 mL de água desionizada e remova suavemente a malha de nylon. Imagine o gel usando um fosforifador. Use as configurações fluorescentes: 520 BP, 40 Azul e 488 nm. Coloque o tubo fotomultiplicador (PMT) em 375, o plano focal para +3 mm e a sensibilidade ao normal. Salve a imagem em um arquivo. </li></ol> 6. Hibridação <ol><li> Prepare a sonda radioativa de telomere. <ol><li> Combine 2 μL (2 ng) de sonda telomere (5- (CCC TAA) 4 3 &#39;), 2,5 μL de 10x tampão de reação de polinucleótido quinase, 3 μL de γ 32 P-dATP (6.000 Ci / mmol), 4 μL de T4 Água desionizada esterilizada e polinucleotídica quinase e DNase livre para um volume final de 20 μL em um micrTubo de ocentrifugação. Cuidado: siga a segurança e regulamentos radioativos das instalações ao usar a radioatividade. </li></ol></li><li> Centrifugue brevemente (10-30 s a 16.000 xg) e incuba em banho-maria a 37 ° C durante 1 h. Centrifugar para 10-30 s a 16.000 xg e incubar a 65 ° C durante 20 minutos para parar a reação. </li><li> Usando uma coluna de microspin de cromatografia G-25, misture o conteúdo da coluna por vortex, depois centrifugue durante 1 min a 700 xg à temperatura ambiente. Descarte o filtrado. </li><li> Carregar a solução de sonda radioativa na coluna de cromatografia G-25 e centrifugar durante 2 minutos a 700 x g. Salve o filtrado. NOTA: Mantenha o filtrado, pois contém a sonda telomere radioativa. A sonda radioativa pode ser armazenada a 4 ° C, se necessário. </li><li> Prepare 250 mL de solução desnaturante composta de NaCl 1,5 M e NaOH 0,5 M em água desionizada estéril. </li><li> Coloque o gel em um prato de vidro contendo 250 mL de solução de desnaturação e incubaçãoComeram durante 15 minutos à temperatura ambiente. Remova a solução de desnaturação e substitua-os por 250 mL de água desionizada estéril. Incubar durante 10 minutos em um agitador orbital (40 - 50 rpm) à temperatura ambiente. </li><li> Prepare 250 mL de solução de neutralização composta de 1,5 NaCl e 0,5 M de Tris-ácido clorídrico, pH 8,0 em água desionizada estéril. </li><li> Remova a água desionizada e substitua-a por 250 mL de solução de neutralização e incube durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Durante a incubação na solução de neutralização, prepare 50 mL de solução de hibridação composta por 5x SSC, solução de 5x Denhardt (0,1% de polímero sintético iônico, 0,1% de polivinilpirrolidina, 0,1% de albumina de soro bovino), fosfato dissódico 10 mM (Na2HPO 4 ) e pirazófato de sódio 1 mM de decaidrato tetrabásico (Na4P2O7.10H2O) em água desionizada estéril. </li><li> Enrole o gel em malha de nylon e coloque no tubo de hibridação (passo5.7). Adicionar 20 mL da solução de hibridação e incubar em um forno de hibridação a 42 ° C durante 10 minutos com rotação. </li><li> Remova a solução de hibridação e substitua por 20 mL de solução de hibridação fresca. Adicione a totalidade da sonda telomere e incuba em um forno de hibridação a 42 ° C durante a noite com rotação. </li></ol> 7. Lavagem de gel, exposição à tela de fósforo e imagem de rádio <ol><li> Preparar 500 mL de solução de SSC 2x (NaCl 300 mM, citrato de sódio 30 mM) em água desionizada estéril. </li><li> Preparar 250 mL de SSC 0,1x (NaCl 15 mM, citrato de sódio 1,5 mM) e 0,1% de sulfato de dodecil de sódio (SDS) em água desionizada. </li><li> Remova o gel e a malha do tubo de hibridação e coloque em um prato de vidro contendo 250 mL de SSC 2x. Desenrolar e remover a malha de nylon do prato. Coloque o prato de vidro em um agitador orbital e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remova o 2x SSC e substitua por 250 mL de 0.1x SSC e 0.1% de solução SDS e incubar durante 15 minutos em um agitador orbital à temperatura ambiente. </li><li> Durante a incubação, exponha a tela Phosphor ao apagador de imagem por 15 min. </li><li> Remova o SSC 0.1x e a solução SDS 0,1% e substitua-os por 250 mL de SSC 2x. Incube durante 15 minutos em um agitador orbital. </li><li> Retire o gel da solução 2x SSC e envolva o gel em plástico ou coloque em uma bolsa termicamente selável. Remova todas as bolhas e bolsos de ar entre o gel e a embalagem de plástico ou bolsa de plástico. Coloque o gel em uma cassete de exposição com a tela Phopshor. Exponha a tela de Fósforo no gel durante a noite. </li><li> Imagem da tela Phosphor exposta usando um fosforifador. </li></ol> 8. Quantificação do comprimento do Telomere <ol><li> Abra o arquivo fosforilador contendo a imagem fluorescente do gel verde-fluorescente de ácido nucleico verde ( Figura 1 ). </li><li> Selecione &#39;Ferramentas&#39; e depois &#39;Distância de Pixel9 ;. Usando o mouse, desenhe uma linha da parte inferior do gel bem para o meio da primeira faixa de marcador e grave a distância. Repita este procedimento para cada faixa de marcador ( Figura 2 ). Essas distâncias serão usadas no programa de gráficos, conforme descrito abaixo. </li><li> Abra a imagem fosforada do gel radiomarcado ( Figura 3 ). Selecione &#39;Gerenciador de objetos&#39; e depois &#39;Grade&#39;. Defina a grade para 1 coluna e 150 linhas. Ajuste a grade de modo que ele se estenda da parte superior do gel até o fundo do gel. Ajuste a largura da grade para igualar a largura da pista, clicando na borda da grade e arrastando a largura da grade para igualar a largura da pista. </li><li> Copie esta grade (para que a largura e a altura das caixas permaneçam iguais) e mova a segunda grade para uma faixa vazia (para fins de fundo). Continue a copiar e mover grades adicionais para pistas de amostra adicionais. NOTA: Quando terminar, deve haverGrades para cada faixa de amostra e uma grade de uma pista vazia para o fundo ( Figura 4 ). </li><li> Selecione &#39;Análise&#39; e depois &#39;Relatório de volume&#39;. Selecione todas as grelhas para o relatório. Uma vez que o relatório de volume é exibido, clique duas vezes no relatório para ativar a planilha. Salve o arquivo da planilha. Os dados para este arquivo serão Sob a faixa &#39;Volume&#39;. </li><li> Abra um programa gráfico apropriado e crie um novo dado e tabela. Selecione &#39;Y: Digite e trace um único valor Y para cada ponto&#39; e selecione &#39;Criar&#39;. </li><li> Rotule a primeira coluna (Coluna X) como &quot;Distância medida&quot; e rotular a segunda coluna (Coluna Y) como &quot;Peso Molecular&quot;. Digite os pesos moleculares do marcador de cada faixa de marcador na coluna Y. Digite as distâncias de migração obtidas no passo 8.2 correspondentes a cada marcador de peso molecular. </li><li> Vá para &#39;Análise&#39; e selecione &#39;Analisar&#39; e depois &#39;Regressi não-linear&#39;On (curve fit) &#39;e selecione&#39; OK &#39;. Na próxima tela, selecione &#39;Exponencial e depois&#39; Decadência de uma fase &#39;. Selecione a guia &#39;Intervalo&#39; e digite &#39;150&#39; em &#39;número de pontos que definem a curva&#39; e marque &#39;Criar uma tabela de coordenadas XY para exportar ou copiar a curva para outro programa&#39;. NOTA: O resultado, &quot;ajuste não linear de dados 1&quot;, contém o peso molecular para cada distância na linha Y. </li><li> Para análise das pistas da amostra, selecione uma área de análise que esteja acima e abaixo das bandas de telómero reais. Não use todo o comprimento da pista ( Figura 5 ). Determine os locais da grade para a área de análise de cada faixa. </li><li> Selecione &#39;Arquivo&#39;, &#39;Novo&#39; &#39;Criar Nova Tabela e Gráfico&#39;. Selecione &#39;Y: Digite e trace um único valor Y para cada ponto&#39; e selecione &#39;Criar&#39;. Copie e cole os valores de volume da linha de fundo (valores de intensidade) do arquivo de planilhaNa primeira coluna (X) e os valores de volume (valores de intensidade) da faixa de amostra para a primeira coluna Y. Se houver várias pistas de amostra, copie cada conjunto de valores de volume do arquivo de planilha em colunas Y adicionais no programa de graficação Arquivo. </li><li> Exclua os valores da coluna de fundo (X) e de cada faixa de amostra (Y) que estão fora das áreas de análise determinadas no passo 8.8. NOTA: A tabela de dados deve conter apenas valores nas áreas de grade correspondentes às áreas de análise. </li><li> Selecione Análise, depois &#39;Analisar&#39; e &#39;transformar&#39;. Clique em &#39;OK&#39;. Selecione &#39;Transformar os valores de Y usando Y = YX&#39;. Isso transformará os dados no Data 2 (valor de intensidade transformada (Y) = intensidade da amostra (Y) - intensidade de fundo (X)). <ol><li> Selecione Análise, depois &#39;Analisar&#39;, &#39;Análise de Colunas&#39; e &#39;Estatísticas de Colunas&#39;. Selecione OK. A guia de resultados &#39;Col. Estatísticas de Transform of Data 2 &#39;mostraSob a linha &#39;Soma&#39;, Σ (Int i ). </li></ol></li><li> Selecione &#39;Arquivo&#39;, &#39;Novo&#39;, &#39;Criar Nova Tabela e Gráfico&#39;. Selecione &#39;Y: Digite e trace um único valor Y para cada ponto&#39; e selecione &#39;Criar&#39;. Copie e cole os dados da coluna Y da página de resultados &#39;Nonlin fit of Data 1, Curve&#39; na nova coluna X. Copie e cole os dados da coluna Y da página de resultados &#39;Transformar dados 2&#39; na nova coluna Y. Selecione Análise, então, &quot;Analisar&quot; e &quot;Transformar&quot;. Clique em &#39;OK&#39;. Selecione &#39;Transformar Y valores usando Y = Y / X&#39;. <ol><li> Selecione Análise, depois &#39;Analisar&#39;, &#39;Análise de Colunas&#39; e &#39;Estatísticas de Colunas&#39;. Selecione OK. A guia de resultados &#39;Col. Estatísticas de Transform of Data 3 &#39;mostra sob a linha&#39; Sum &#39;, Σ (Int i / MW i ). MW = peso molecular. </li></ol></li><li> Para calcular o comprimento médio de telómero (TL) para cada amostra, use oFórmula TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ). </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+telomere+sequences+in+birds:+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening.">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li><li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+(flow+FISH).">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li><li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+in+epidemiology:+a+biomarker+of+aging,+age-related+disease,+both,+or+neither.">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li><li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts.">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Após a eletroforese, o esfregaço de DNA genômico é superior a 800 pb. Isso pode ocorrer se as enzimas de restrição estiverem com defeito ou se forem necessárias enzimas adicionais (conforme descrito acima). Uma segunda explicação possível é que a proteína ainda está ligada ao DNA. Ao determinar a concentração de DNA por espectrofotômetro, a razão 260/280 deve ser em torno de 1,8. Se essa proporção for &lt;1,5, existe uma contaminação protéica que pode interferir com a digestão das enzimas de restr...

Telomeres, situados nas extremidades dos cromossomos, são repetições nucleotídicas da sequência TTAGGG (nos cromossomos humanos) que desempenham um papel crítico na proteção da informação genética celular 3 , 4 , 5 . Os telômeros são vários milhares de pares de bases e servem para proteger a integridade do resto do cromossomo durante a replicação do DNA. A replicação de cromossomos não é perfeita, resultando nas extremidades do cromossomo não serem completamente copiadas. Essa ineficiência na replicação é denominada &quot;problema de replicação final&quot; e resulta na perda de algumas das repetições de telômeros durante cada rodada de replicação 6 , 7 . O comprimento do Telomere pode ser restaurado após a divisão celular pela telomerase, uma enzima que substitui as sequências de telómeros perdidos 8 , 9 . A Telomerasa, no entanto, não éAtivado na maioria das células somáticas humanas e, como resultado, ao longo do tempo, os telômeros encurtarão, resultando em senescência celular 10 . Devido ao encurtamento de telomere, os telômeros são considerados como um biomarcador do envelhecimento e risco de doenças relacionadas com a idade 11 , 12 . Além disso, o comprimento do telómero pode ser afetado por fatores genéticos, ambientais e de estilo de vida e outros estímulos como o estresse oxidativo, indicando que o comprimento dos telômeros pode desempenhar um papel como biomarcador em estudos toxicológicos, epidemiológicos e comportamentais 13 , 14 , 15 . Este artigo demonstra uma técnica para medir o comprimento do telômero usando uma análise de fragmento de restrição terminal modificada (TRF) adaptada de Mender e Shay 2 e Kimura et al. 16 , e semelhante a Herbert, Shay e WrigHt 1 e Haussmann e Mauck 17 . Tradicionalmente, a análise TRF envolve um procedimento Southern Blot. As transferências de Southern são consideradas como &quot;padrão de ouro&quot; para o estudo do comprimento dos telômeros e são ativamente usadas para examinar o comprimento dos telócitos dos leucócitos em estudos de epidemiologia 18 . Esta análise TRF usa DNA genômico digerido deixando atrás as repetições de telômeros. Os fragmentos de DNA são então separados por eletroforese em gel, desnaturados e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As sequências de telômeros são hibridizadas com uma sonda oligonucleotídica telomereira. Em vez de transferir os telômeros separados para uma membrana, outras técnicas de TRF usam técnicas de hibridação em gel com e sem desnaturação do DNA. A inclusão da desnaturação é importante quando se considera a detecção de telômeros intersticiais, que foram relatados em algumas espécies 19 . Os procedimentos que não possuem etapas desnaturantes apenas detectamE as gotas de DNA de cadeia simples em telômeros terminais e não se ligam a seqüências de telômeros intersticiais 18 . Além da análise TRF, existem várias outras técnicas para medir o comprimento do telômero, que cada uma tem suas próprias vantagens e desvantagens. A técnica Flow-FISH pode medir o comprimento médio do telômero de células individuais de um tipo de célula distinto usando citometria de fluxo 16 , 20 . Embora possa marcar com precisão os telômeros com sondas altamente específicas e reduzir o erro humano através da automação, o Flow-FISH é caro, menos eficiente e requer amostras frescas e um técnico altamente qualificado, limitando sua capacidade de estudos epidemiológicos 16 . Além disso, esse método não explica mudanças potenciais no número de cromossomos na população celular. Outra técnica, qPCR, é amplamente aceita como meio de medir o comprimento dos telômeros para estudos de epidemiologia <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 devido ao seu alto rendimento, baixo custo e exigência de pequenas quantidades de DNA em comparação com outros métodos. No entanto, qPCR só pode medir o conteúdo médio de DNA telomérico em relação a um gene de cópia única e, portanto, é uma estimativa indireta do comprimento médio dos telômeros. Ele também produz um alto coeficiente de variância em estudos de comparação, em comparação com manchas do sul, levando a uma precisão questionável 21 . O procedimento TRF tem suas próprias deficiências que limitam seu uso para alguns estudos. As técnicas TRF requerem uma grande quantidade de DNA em comparação com outros métodos (entre 2 e 3 μg por amostra). Isto limita as aplicações da técnica ao exame do comprimento do telômero de amostras clínicas para as quais pode ser coletado DNA genômico suficiente e não pode ser usado em amostras de DNA degradadas. Além disso, a análise TRF é dispendiosa e intensiva em mão-de-obra, exigindo 4-5 dias para produzir resultados. No entanto, o TRF produz um baixo coeficiente de variaçãoConcedendo sua reprodutibilidade. Embora este protocolo seja diferente do tradicional Southern Blot (utilizando hibridação em gel in situ ), as duas técnicas são fundamentalmente as mesmas. A técnica apresentada aqui é uma combinação de uma transferência de Southern e hibridação em gel; Associando o passo de desnaturação do DNA de Southern Blots com a hibridação em gel. Esta combinação tem o benefício adicional da intensidade do sinal da sonda melhorada em comparação com o Southern Blot e produziu consistentemente resultados quantificáveis ​​dentro do nosso laboratório. Além disso, o uso de sondas radioativas ao invés de sondas quimioluminescentes produz maior intensidade de sinal e permite a visualização e quantificação com um agente de fosforilação, tornando as análises do TRF fáceis de usar.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Biologics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, restriction enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10,000 U/mL, DNA digestion.&amp;nbsp; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td></tr><tr><td>Hinf1, restriction enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10,000 U/mL, DNA digestion.&amp;nbsp; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td>electrophoresis grade agarose</td></tr><tr><td>Optikinase&amp;nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Polynucleotide Kinase</td></tr><tr><td>SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber Green</td></tr><tr><td>exactGene DNA Ladder 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>C-Strand Probe (3&#039;-(G3AT2)4-&#039;5)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Custom ordered DNA oligonucleotide</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>Radioisotope</td></tr><tr><td>Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>For purification of readioactive oligo probe</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td><td>non-ionic synthetic polymer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment/Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td>Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Nylon mesh, 50, 12&quot; x 12&quot;</td><td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor Screen Exposure Cassette</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Hybridzation Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q</td><td></td></tr><tr><td>Cylindrical hybridization tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>The Belly Dancer orbital shaker</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>Orbital shaker</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>For imaging of gels and phosphor screens</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad</td><td>Version 6.05</td><td>Graphing Program</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>Spreadsheet program</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrp 2000</td><td>Spectrophotometer</td></tr></tbody></table>

modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization

Existem várias técnicas diferentes para medir o comprimento dos telômeros, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens. A abordagem tradicional, análise do Fragmento de Restricção de Telomere (TRF), utiliza uma técnica de hibridação de DNA, por meio da qual as amostras de DNA genômico são digeridas com enzimas de restrição, deixando para trás as repetições de DNA de telómero e algum DNA sub-telomérico. Estes são separados por electroforese em gel de agarose, transferidos para uma membrana filtrante e hibridizados com sondas oligonucleotídicas etiquetadas com quimioluminiscência ou radioactividade para visualizar fragmentos de restrição telomere. Esta abordagem, ao mesmo tempo que exige uma maior quantidade de DNA do que outras técnicas como a PCR, pode medir a distribuição do comprimento dos telômeros de uma população de células e permite a medição expressa em kilobases absolutas. Este manuscrito demonstra um procedimento de hibridação de DNA modificado para determinar o comprimento do telômero. O DNA genômico é digerido pela primeira vez com enzimas de restrição (que não cortamTelômeros) e separados por eletroforese em gel de agarose. O gel é então seco e o ADN é desnaturado e hibridado in situ com uma sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridização in situ evita a perda de DNA dos telómeros e melhora a intensidade do sinal. Após a hibridação, os géis são criados utilizando telas de fósforo e o comprimento do telômero é quantificado usando um programa gráfico. Este procedimento foi desenvolvido pelos laboratórios dos Drs. Woodring Wright e Jerry Shay na Universidade do Texas Southwestern 1 , 2 . Aqui, apresentamos uma descrição detalhada deste procedimento, com algumas modificações.

Foram analisadas três concentrações de DNA (1, 2 e 3 μg) isoladas da linha celular BJ-HTERT (fibroblastos de prepúcio humano imortalizado com telomerase) 22 e células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) para o comprimento do telômero. A Tabela 1 mostra as atribuições da pista para cada amostra de DNA. A Figura 1 mostra uma mancha fluorescente de ácido nucleico do gel. Os padrões de peso molec...

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Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Neste artigo, discute-se um protocolo detalhado para quantificar o comprimento do telômetro usando uma análise do fragmento de restrição terminal modificada que fornece uma medição direta rápida e eficiente do comprimento do telômero. Esta técnica pode ser aplicada a uma variedade de fontes celulares de DNA para quantificar o comprimento dos telômeros.

Análise de fragmentos de restrição de terminal modificada para quantificar o comprimento de Telomere usando a hibridação em gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.8K visualizações.  University of Pittsburgh.  Neste artigo, discute-se um protocolo detalhado para quantificar o comprimento do telômetro usando uma análise do fragmento de restrição terminal modificada que fornece uma medição direta rápida e eficiente do comprimento do telômero. Esta técnica pode ser aplicada a uma variedade de fontes celulares de DNA para quantificar o comprimento dos telômeros. 

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Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Exame da estrutura G-Telomere saliência na Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Imunologia e Infecção

Laparoscopic Pancreatoduodenectomy With Modified Blumgart Pancreaticojejunostomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal pancreatectomy, laparoscopic pancreatoduodenectomy (LPD) has not yet obtained wide acceptance, probably due to technical challenges, especially regarding the pancreatic anastomosis.
The study describes and demonstrates all steps of LPD, including the modified Blumgart pancreaticojejunostomy. Indications for LPD are all pancreatic and peri-ampullary tumors without vascular involvement. Relative contra-indications are body mass index &#62;35 kg/m2, chronic pancreatitis, mid-cholangiocarcinomas and large duodenal cancers.
The patient is in French position, 6 trocars are placed, and dissection is performed using an (articulating) sealing device. A modified Blumgart end-to-side pancreaticojejunostomy is performed with 4 large needles (3/0) barbed trans-pancreatic sutures and 4 to 6 duct-to-mucosa sutures using 5/0 absorbable multifilament combined with a 12 cm, 6 or 8 Fr internal stent using 3D laparoscopy. Two surgical drains are placed alongside the pancreaticojejunostomy.
The described technique for LPD including a modified Blumgart pancreatico-jejunostomy is well standardized, and its merits are currently studied in the randomized controlled multicenter trial. This complex operation should be performed at high-volume centers where surgeons have extensive experience in both open pancreatic surgery and advanced laparoscopic gastro-intestinal surgery.

Laparoscopic pancreatoduodenctomy (LPD) may offer advantages over open pancreatoduodenectomy, including early postoperative mobilization, less delayed gastric emptying and a shorter hospital stay. However, LPD is technically challenging and not well-standardized, especially regarding the pancreatic anastomosis. We describe a standardized technique for the pancreatic anastomosis during LPD: modified Blumgart pancreaticojejunostomy.

Duodenopancreatectomia laparoscópica com modificado Blumgart pancreatoyeyunostomía

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal ...

Pesquisa do câncer

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Genética

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação precisa do comprimento dos telômeros em estudos populacionais humanos

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: explorando o impacto do trauma no envelhecimento celular

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Medição quantitativa multiplex monocromática do comprimento do telômero do PCR 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Quantificando o comprimento dos telômeros usando detecção de quimioluminescência não radioativa

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Autor em destaque: Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento dos telômeros TAGGG  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

Análise de fragmentos de restrição de terminal modificada para quantificar o comprimento de Telomere usando a hibridação em gel

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