Name: mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pela Fundação de ciência de Israel (grant 748/14), Marie Curie integração conceder (CIG) - FP7-pessoas-20013-CIG-618763 e eu-núcleo programa de planejamento e orçamento do Comité e o Israel Science Foundation concedem n º 41/11.

todos os procedimentos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Bar Ilan e o protocolo segue as orientações fornecidas pelo Comitê aprova os experimentos.
 1. purificação da ingenuidade humana células CD4 + e polarização para T Helper 1 (Th1) e células Th2 Nota: Aqui descrevemos o procedimento a partir de células mononucleares de sangue periférico humano congelado (PBMC). O primeiro passo consiste em isolar as células CD4 + usando microbeads e colunas que normalmente dão-nos mais do que 95% das células CD4 +. No entanto, esta etapa pode variar de acordo com o protocolo preferido em cada laboratório. O protocolo para a ativação de células T e polarização foi modificado de Jenner et al (2009) 18. isolamento de CD4 + células de 10 milhões PBMCs dá origem a 4 milhões de células CD4 +. Eles são divididos em dois balões e cultivados em células Th1 e Th2 polarizador condições rendendo as células Th1 e Th2 3 milhões em apenas uma semana.
 Nota: arrefecer o centrifugador a 4 ° C antes de iniciar.
<ol><li>Descongelar 1 mL de PBMC humano (10 7 células) em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio RPMI suplementado com 1% penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino. Centrifugar a 500 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com uma pipeta estéril 25 mL em 15 mL de meio RPMI completado. Transferir as células (com pipeta estéril 25 mL) para um frasco de cultura T75.</li>
	<li>Deixar as células durante a noite em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO 2).</li>
	<li>Transferir as células flutuantes com uma pipeta estéril 25 mL para tubo de 50 mL. Determinar o número de telemóvel e viabilidade pela exclusão trypan azul.</li>
	<li>Células isolar CD4 + de 10 milhões vive não-aderente PBMC por selecção positiva usando colunas de acordo com o fabricante e CD4 + microbeads &#39; recomendações de s (veja a Tabela de materiais e equipamentos) com o seguinte modificações: 10 7 PBMCs são rotulados com 30 µ l de CD4 microbeads em 120 µ l de BSA de 0,5% em PBS.</li>
	<li>Ativar as células T CD4 + para 72 h por rhIL-2 (10 ng/mL), ligados a placa anti-CD3 (5 µ g/mL) e anti-CD28 solúvel (2 µ g/mL). Para a polarização Th1, adicione rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Para a polarização de Th2, adicionar rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).</li>
	<li>Cultura de células para adicionais 7 dias na presença de rhIL-2 (10 ng/mL) e as mesmas citocinas polarizadores (rhIL-12 para Th1 e rhIL-4 para Th2).</li>
</ol> 2. Isolamento de núcleos Nota: ATAC-seq é executada com núcleos intactos. Lise tampão contendo 0.05% nonilfenil polietilenoglicol (ver Tabela de materiais e equipamentos) foi calibrado para isolar núcleos de células Th1 e Th2 de humano primários. É recomendável calibrar este passo com os reagentes de laboratório e células. Um excesso de células intactas de insuficiente detergente diminui a eficiência da reação de transposição. Eficiência de lise celular é determinada pelo número de núcleos (células positivas de trypan azul) em relação ao número total de células. 
Nota: Prepare o tampão de lise (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl 2). Arrefecer uma centrífuga com um rotor de balanço-balde de 4 ° C. as células em uma centrífuga de balanço-balde em vez de uma centrífuga de ângulo fixo de granulação reduz a perda de células/núcleos. Para evitar núcleos ou perda de celular, pipeta com cuidado ao descartar o sobrenadante.
<ol><li>Adicionar nonilfenil fresco polietilenoglicol (para obter uma concentração final de 0.05%) e 100 x inibidores de protease (para obter uma concentração final de 1-x) para o frio do lysis imediatamente antes do uso. Mantenha o buffer no gelo</li>
	<li>Células Count T para determinar sua quantidade e viabilidade usando trypan azul método. Viabilidade que seja inferior a 90% de resultados na maior digestão específico.</li>
	<li>Transferência de 0,5 x 10 6 T células (células Th1 ou Th2) para microtubos de 1,5 mL. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) solução fria. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de tampão de Lise fria (contendo nonilfenil polietileno glicol e inibidores da protease). Mantenha o tubo no gelo. Pipeta suavemente para não perturbar os núcleos.</li>
	<li>, Rapidamente, Pegue 10 µ l e conte as células com um contador de célula automatizada enquanto o microtubo com lisados células está no gelo. Esta etapa não deve exceder cinco minutos para não danificar os núcleos. Pelo menos 80% das células deve ser lysed.</li>
	<li>Continuar imediatamente com a reação de transposição. Manter os núcleos preparados sobre o gelo</li>
</ol> 3. Reação de transposição Nota: nesta etapa, núcleos isolados são incubados com procarióticas Tn5 transposase (TDE1) carregado com adaptadores para sequenciamento NGS. Tn5 hiperativo, simultaneamente, fragmentos de DNA e ligates adaptadores em acessíveis regiões do genoma (processo tagmentation). A relação entre núcleos e Tn5 transposase é crítica para clivagem preferencial na cromatina acessível. Este protocolo é calibrado para 100.000 núcleos em um volume de reação de 100 μL. No entanto, a reação pode ser escalada para baixo.
<ol><li>Definir a temperatura em uma coqueteleira térmica a 37 ° C.</li>
	<li>Núcleos de 100.000 transferir para um microtubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar 500 x g por 10 min a 4 ° C e delicadamente Retire o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar os componentes de reação de transposição para os núcleos especificados no quadro 1.</li>
	<li>Resuspenda pipetando gentil.</li>
	<li>Incubar a reação de transposição em uma coqueteleira térmica a 37 ° C por 30 min com leve agitação (500 rpm). 
	Nota: A limpeza de DNA é executada por fase sólida reversível imobilização grânulos 19 (ver Tabela de materiais e equipamentos) ou colunas de purificação do PCR. No final da limpeza, eluir os fragmentos de DNA em 20 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitar o EDTA no buffer de eluição.</li>
</ol> 4. Enriquecimento de PCR das bibliotecas ATAC-seq Nota: esta etapa destina-se a amplificar os ATAC-seq biblioteca ou seja, fragmentos de DNA com adaptadores inseridos. Para permitir a mistura de várias bibliotecas de ATAC-seq na pista mesmo sequenciamento de nova geração (&#34; multiplexação &#34;) uso unindexed Primer 1 (Ad1_noMx) 1 para todas as amostras, e uma diferente indexados (código de barras) 2 Primer (Ad 2.1-2,24) 1 para cada amostra. As sequências de primeira demão são fornecidas no complementado Tabela de materiais e equipamentos.
<ol><li>Amplificação por PCR inicial Nota: A concentração de trabalho de Primer 1 (Ad1_noMx) e Primer 2 é de 25 µM. Todos os primers são diluídos do estoque original de 100 µM para 25 µM. Em todas as reações de PCR, use Primer 1 (Ad1_noMx) e apenas um do indexado 2 Primer.
	<ol><li>Adicionar os componentes da reação de PCR como especificado na tabela 2, a um tubo estéril de PCR.</li>
		<li>Lugar PCR do tubo em um termociclador e realizar a amplificação por PCR usando as ciclismo condições detalhadas na tabela 3.</li>
	</ol></li> <li>Avaliação do número de ciclos de amplificação adicional Nota: O número de ciclos PCR adicionais deve produzir quantidade suficiente de biblioteca fragmentos fou um sequenciamento de próxima geração bem sucedido executado, enquanto minimizado para evitar GC e dimensionar o viés 20. A determinação do número de ciclos PCR (N) necessário para amplificação de fragmento de biblioteca ideal é feita por PCR quantitativo (qPCR).
	<ol><li>Diluir 1 de Primers (Ad1_noMx) e 2 (usado para a amplificação da biblioteca inicial) de 25 µM a 6,25 µM.</li>
		<li>Adicionar os componentes ópticos da polimerase ou uma placa, como indicado na tabela 4.</li>
		<li>Lugar em um instrumento de qPCR e ciclo como especificado no quadro 5.</li>
		<li>Para estimar o número necessário de ciclos de amplificação adicional (N), lote número de ciclo sobre o eixo x e a fluorescência relativa (RFU) no eixo y.</li>
		Ciclos de <li>o número de amplificação adicional (N) é 1/3 do número de ciclos em que a reação de qPCR alcançado o planalto. a Figura 2 fornece exemplos para três bibliotecas ATAC-seq patamar no ~ 2.350 unidades de fluorescência relativo, RFU (linha grossa verde). O número de ciclos PCR, em que um terço da quantidade máxima (RFU 783, marcado no eixo y) é amplificado corresponde a 8 ciclos por duas das bibliotecas (curvas de amplificação de vermelho e azul) e 9 ciclos PCR para a biblioteca de terceiro (rosa).</li>
	</ol></li> <li>Amplificação por PCR final <ol><li>amplificar o restante µ 45 l da reação de PCR. Coloque um tubo PCR contendo a reação de amplificação da etapa 4.1.2 em um termociclador. Execute o programa PCR descrito na tabela 6. Use o número de ciclos de amplificação (N) previamente determinado (etapa 4.2.5).</li>
	</ol></li></ol> 5. Seleção de ATAC-Seq bibliotecas do tamanho Nota: na nossa experiência, seleção de tamanho de amplificado ATAC-seq bibliotecas melhora os resultados de sequenciamento de próxima geração porque elimina fragmentos de biblioteca de alto peso molecular da final biblioteca ATAC-seq. 
Nota: Permitir que os grânulos magnéticos aquecer a temperatura ambiente 30 min antes do uso. 
Prepare-se fresco 70% de etanol em água livre de nuclease.
<ol><li>Resuspenda os grânulos magnéticos misturando.</li>
	<li>Adicionar água nuclease-livre para as bibliotecas de ATAC-seq (obtidas na etapa 4.3.1.) e levar até 100 µ l.</li>
	Adicionar 50 µ l de <li>(0.5 x) de ressuspensão grânulos magnéticos do DNA-ligando a 100 µ l de bibliotecas amplificadas. Misture pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Incube as amostras por 5 min à temperatura ambiente. Se necessário, girar rapidamente para baixo os microtubos.</li>
	<li>Colocar o tubo em um carrinho magnético apropriado por 2 min separar as esferas magnéticas do sobrenadante. Depois de 2 min, transfira o sobrenadante para um microtubo novo.</li>
	<li>Medir o volume do líquido sobrenadante pipetando e adicionar 0,7 x de grânulos magnéticos. Mix pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.</li>
	<li>Incubar 5 min à temperatura ambiente. Lugar num suporte magnético para 2 min.</li>
	<li>Após o 2 min incubação, desprezar o sobrenadante. Adicionar 200 µ l acabadas etanol a 70% para lavar os grânulos quando os tubos forem depor magnético.</li>
	<li>Manter o microtubo sobre o ímã por 30 s e depois descartar o etanol. Repita a etapa 5.7.for duas lavagens de etanol final.</li>
	<li>Remover completamente o restante do etanol e deixe que os grânulos secar ao ar por 5 min enquanto o tubo é sobre o ímã. Se necessário, gire brevemente o microtubo. Remover os vestígios de álcool etílico com uma ponta de pipeta p10.</li>
	<li>Remover o microtubo de ímã e adicione 22 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Não eluir as ATAC-seq bibliotecas em tampão contendo EDTA.</li>
	<li>Incubar o tubo para 2 min à temperatura ambiente e coloque sobre o suporte magnético.</li>
	<li>Quando a solução é clara, 20 µ l de eluted bibliotecas de transferência para um novo microtubo estéril.</li>
	<li>Loja do tamanho selecionado ATAC-seq bibliotecas em -20 ° C.</li>
</ol> 6. Análise da qualidade das bibliotecas ATAC-Seq <ol><li>validação da qualidade da ATAC-seq bibliotecas por PCR em tempo real Nota: é importante avaliar a relação sinal / ruído das bibliotecas ATAC-seq antes da próxima geração sequenciamento. Isso é feito, determinando a quantidade relativa de fragmentos de DNA de loci acessível e inacessível usando PCR quantitativo (qPCR). Os loci inacessível (controlo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) são amplificados por pares da primeira demão, 1 e 2. Os loci acessível (controle positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) são amplificados por pares da primeira demão, 3 e 4. Positivos e negativos de loci foram definidos a partir de perfis de acessibilidade (DHS-seq) cromatina das células humanas CD4 + (ENCODE adesões ENCSR000EQE e ENCSR000EQG). Primeira demão negativo 1 situa-se em uma grande região intergênica heterocromático (230 kb de TRADB2 e 88 kb de FOXD2). Região de controle negativo, 2 é dentro o primeiro intron do gene CDC73. Positivo par de primer 3 está dentro de uma região de cromatina aberta a jusante do gene E Cyclin (CCNE1) ao par de primer positivo 4 é centralizada dentro do promotor da proteína quinase C substrato 80K-H (PRKCSH). Importante, estes loci de controle mostra um padrão semelhante de acessibilidade em outros tipos de células humanas do ENCODE projeto 3, sugerindo que eles podem ser aplicados para monitorar ATAC-seq bibliotecas de um amplo espectro de tipos de células humanas. Cartilha eficiência e especificidade de todos os pares da primeira demão foi verificado por qPCR em uma diluição serial do DNA genômico (a partir de células humanas de Th) e uma análise de curva derretimento dos obtidos produtos amplificados.
	<ol><li>Isolar o DNA genômico, usando um comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais e equipamentos).</li>
		<li>Diluir o ATAC-seq amplificado biblioteca 01:10 (1 µ l biblioteca + 9 µ l de água livre de nuclease) e o DNA genômico de ~ 5 ng / µ l.</li>
		<li>Preparar a mistura de reacção (tabela 7) para cada par de primer de controlo positivo e negativo, tendo em conta que as reações são realizadas em triplicata.</li>
		<li>Incubar em termociclador qPCR, de acordo com o protocolo recomendado pelo fornecedor de mestre mistura qPCR.</li>
		<li>Analisar os resultados em instrumento de qPCR &#39; software s (consulte a Tabela de materiais e equipamentos). Escolha o DNA genômico como uma amostra de controle. Os valores obtidos representam um enriquecimento das regiões acessíveis (amplificados pelos iniciadores de controle positivo). Um exemplo é mostrado na tabela 8. 
		Nota: Estimativa do tamanho médio de biblioteca e concentração: a distribuição de tamanho de fragmentos de DNA de bibliotecas ATAC-seq é determinada por sistemas automatizados electroforese de alta sensibilidade, de acordo com o fabricante &#39; instruções s. É aconselhável medir a concentração da amostra em um dados usando o kit de alta sensibilidade de dsDNA e pelo menos 2 µ l de cada amostra de DNA. 
		Nota: Sequenciamento de próxima geração - antes da multiplexação as bibliotecas, calcule a molaridade de cada biblioteca ATAC-seq usando a fórmula: (ng / µ l x 10 6) / (comprimento do fragmento de 660 x biblioteca média). Mire &#62; 30 milhões leituras de cada biblioteca ATAC-seq para avaliar aberta da cromatina regiões de amostras humanas. Se você quiser determinar se a biblioteca é bom o suficiente para o sequenciamento de NGS, inicialmente, Mire lê 10 milhões (5% da faixa de sequenciamento em instrumento de sequenciamento de DNA no modo de execução rápido). Tenha em mente que para inferir nucleossoma posicionamento, sequenciamento emparelhado-final é necessário 1.</li>
	</ol></li></ol> 7. Análise dos resultados obtidos Next-Generation sequenciamento <ol><li>inferir a qualidade do sequenciamento diz inspecionando os arquivos FastQC, separadamente para cada biblioteca.</li>
	<li>Alinhar o lê a referência humana do genoma (conjunto hg19) usando Bowtie 21 software em ambiente Unix/Linux. O comando é &#39; bowtie -m 1 - q -S genoma diretório reads.fastq output_aligned.sam &#39;. Diretório de genoma representa a pasta onde os índices de genoma de gravata são armazenados. O parâmetro -m 1 é para não permitir o alinhamento de leituras para mais de um locus no genoma, - q é para o arquivo de entrada deve estar no formato fastq, destina-se a saída que está no formato de SAM -S.</li>
	<li>Remover duplicadas leituras usando SAMtools 22 rmdup opção no ambiente Unix/Linux. Os comandos são &#39; samtools Ver os output_aligned.sam -b -S | samtools classificar -o-output_aligned &#62; output_aligned.bam &#39;, samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam &#39;. O primeiro comando, vista, altera o formato de SAM em formato BAM, que é então classificado. A opção de rmdup é então aplicada sobre o arquivo BAM classificado. Opcionalmente, um pode ajustar as leituras para o local de inserção do transposon, conforme descrito na ATAC-seq original papel 1. Isso é feito usar BEDtools comandos 23 no ambiente Unix/Linux. Os comandos são &#39; bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam &#62; output_aligned _rmdup.bed &#39;, &#39; shiftBed -i output_aligned genoma do _rmdup.bed -p - m-5 - 4G &#62; output_aligned _rmdup_adjusted.bed &#39;. O primeiro comando, bamTobed, altera o formato BAM em formato de cama, que pode ser usado para o comando shiftBed. O arquivo do genoma é um arquivo delimitado por tabulação que contém o comprimento de cada cromossomo no genoma. O arquivo é adicionado geralmente no diretório BEDtools.</li>
	Chamada de pico <li>Executar usando análise baseada em modelo de ChIP-seq (MACS2) 24 software no ambiente Unix/Linux no arquivo deslocado de cama, com os seguintes parâmetros: - nomodel - extsize 75-- shift -30. Esses parâmetros são usados para ajustar as leituras para que o local de inserção do transposon é no meio de cada leitura do sequenciamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).</li><li>Thurman, R. 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Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo de ATAC-seq descrito aqui tem sido empregado com sucesso para a análise da cromatina acessível em células primárias (humano Th1, Th2 pilhas e pilhas de B) bem como as linhas de células cultivadas (células de câncer de mama humano MCF10A e células de glioblastoma U261). Aplicação de ATAC-seq para outros tipos de células pode exigir alguma otimização de protocolo, especialmente na etapa de Lise. Se a concentração de detergente não-iônico é muito alta, pode haver um maior percentual de contamin...

ATAC-seq1,2 é um método robusto que permite a identificação de regiões de cromatina aberta regulamentar3 e posicionamento nucleossoma. Esta informação é aplicada para inferir a localização, identidade e atividade de fatores de transcrição. Sensibilidade do método para a medição quantitativas variações na estrutura da cromatina permite o estudo da atividade dos fatores de cromatina, incluindo empresas de reestruturação da cromatina e modificadores, bem como a atividade transcricional do RNA polimerase II1. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem poderosa e imparcial para decifrar os mecanismos que regem o Regulamento transcriptional em qualquer tipo de célula de interesse. Descrevemos a adaptação da ATAC-seq para as células Th1 e Th2 humanas primárias.
Na ATAC-seq, hiperativo Tn5 transposase carregado com adaptadores para sequenciamento de próxima geração (NGS) fragmentação de DNA de casais com marcação de DNA com adaptadores (ou seja, o processo de "tagmentation")1. Após amplificação por PCR, as bibliotecas de DNA resultantes estão prontas para a próxima geração sequenciamento (Figura 1). O tagmentation preferencial da cromatina acessível é detectado pela análise de enriquecimento local de leituras de sequenciamento ATAC-seq.
O procedimento experimental curto e exigência de menos matérias-primas, em relação a outros métodos para medir a acessibilidade da cromatina e posicionamento de partícula como de DNase-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, tem promoveu o uso de ATAC-seq em vários sistemas biológicos, incluindo células humanas primárias1,7 e amostras clínicas8, bem como organismos unicelulares9, plantas10, moscas de fruta11 e vários mamíferos12.
A identidade da transcrição de fatores que estão ligados a loci acessível podem ser descobertos por analisar o enriquecimento de seus motivos de sequência de ligação ou combinando ATAC-seq com imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida de alta produtividade (de sequenciamento de DNA ChIP-seq). Essa abordagem permitiu a identificação de fatores de transcrição de linhagem-específicos importantes para hematopoiese em rato13. A natureza global e imparcial da ATAC-seq permite estudar a regulação gênica em organismos para os quais reagentes tais como anticorpos para análise de ChIP não estão disponíveis. Por exemplo, evolutivas variações no cis-regiões reguladoras foram identificadas pelo estudo craniana crista neural células de seres humanos e os chimpanzés14, variações do desenvolvimento em elementos reguladores durante o início do mouse embriogénese15, mudanças na paisagem regulamentar durante um ciclo de vida de unicelulares owzarzaki c.9e a evolução dos promotores e potenciadores em toda espécie de mamífero 2012.
ATAC-seq também tem sido fundamental para medir a acessibilidade de cromatina em células individuais, assim revelando variabilidade dentro das populações de células, que normalmente evita todo o genoma estudos7,16. Além disso, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças que ocorrem em regiões reguladoras de DNA em condições de doença, em que as amostras são raras. Por exemplo, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças na paisagem regulamentar durante o início da leucemia mieloide aguda (LMA)17 ou Ras-conduzido mixomas11.

<table><tbody><tr><td>50 mL tubes</td><td>Lumitron</td><td>LUM-CFT011500-P</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Axygen Inc</td><td>MCT-175-C</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>25 mL serological pipettes</td><td>Corning Costar</td><td>4489</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Tissue culture flask</td><td>Lumitron</td><td>LUM-TCF-012-250-P</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Countes Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>Peripheral blood mononuclear cells&amp;nbsp;(PBMC)</td><td>ATCC</td><td>&amp;nbsp;PCS&amp;shy;800&amp;shy;011</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS),&amp;nbsp;Heat Inactivated, European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>MACS CD4 microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD4 FITC</td><td>Biogems</td><td>06121-50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype Control FITC</td><td>Biogems</td><td>44212-50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 (OKT3)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>40-0037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD28 SAFIRE Purified</td><td>Biogems</td><td>10311-25</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL4</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL12 p70</td><td>Peprotech</td><td>200-12</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)</td><td>Tonbo</td><td>40-7048</td><td></td></tr><tr><td>LEAF&amp;nbsp;Purified anti-human IFN-&amp;gamma;</td><td>BioLegend</td><td>506513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, analytical grade</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>800682</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Tris, ultra pure, 99.9% pure</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Protease Inhibitors</td><td>Sigma</td><td>P2714</td><td>this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.</td></tr><tr><td>Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads</td><td>Beckman</td><td>63881</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>HyLabs</td><td>EX-GP200</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;CFX Connect Real-Time PCR&amp;nbsp;Detection&amp;nbsp;System</td><td>Bio-rad</td><td>185-5200</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>CFX Manager Software</td><td>Bio-rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5124</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Qubit fluorometer 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Magnet for eppendorf tubes</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004527</td><td>Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.</td></tr><tr><td>Thermo-shaker</td><td>MRC</td><td></td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation system</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>Tape-based platform for&amp;nbsp; electrophoresis</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer name and sequence</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ad1_noMX: 5&#039;-AATGATACGGCGACCACCGAGA&lt;br/&gt; TCTACACTCGTCGGCAGCGTC&lt;br/&gt; AGATGTG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad1-noMx: 5&#039;-P5 sequence-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.1_TAAGGCGA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt; AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.1_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.2_CGTACTAG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt; AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.2_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.3_AGGCAGAA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.3_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.4_TCCTGAGC: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt; AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.4_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.5_GGACTCCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.5_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.6_TAGGCATG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.6_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.7_CTCTCTAC: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.7_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.8_CAGAGAGG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.8_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.9_GCTACGCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.9_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.10_CGAGGCTG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACG&lt;br/&gt; AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG&lt;br/&gt; GCTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.10_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.11_AAGAGGCA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACG&lt;br/&gt; AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.11_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.12_GTAGAGGA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACG&lt;br/&gt; AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.12_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.13_GTCGTGAT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.13_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.14_ACCACTGT: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.14_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.15_TGGATCTG: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.15_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.16_CCGTTTGT: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.16_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.17_TGCTGGGT: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.17_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.18_GAGGGGTT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.18_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.19_AGGTTGGG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.19_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.20_GTGTGGTG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.20_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.21_TGGGTTTC: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.21_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.22_TGGTCACA: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt;TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.22_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.23_TTGACCCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt;TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.23_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.24_CCACTCCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt;CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.24_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F1: 5&#039;-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R1: 5&#039;-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F2: 5&#039;-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R2: 5&#039;-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F3: 5&#039;-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R3: 5&#039;-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4: 5&#039;-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R4: 5&#039;-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq

Ensaio para cromatina Transposase-acessível com arranjar em sequência do elevado-throughput (ATAC-seq) é um método usado para a identificação das regiões (acessíveis) abertas da cromatina. Essas regiões representam DNA elementos reguladores (por exemplo,promotores, melhoradores, regiões de controle de locus, isoladores) ao qual transcrição fatores bind. Mapeamento da paisagem de cromatina acessível é uma poderosa abordagem para descobrir elementos reguladores ativos através do genoma. Esta informação serve como uma abordagem imparcial para descobrir a rede de fatores de transcrição relevantes e mecanismos da estrutura da cromatina que regem os programas de expressão do gene. ATAC-seq é uma alternativa robusta e sensível à DNase eu análise de hipersensibilidade juntamente com a próxima geração sequenciamento (DNase-seq) e formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para análise de todo o genoma da cromatina acessibilidade e para o sequenciamento de micrococcal nuclease sensíveis sites (MNase-seq) para determinar o posicionamento do nucleossoma. Apresentamos um protocolo detalhado de ATAC-seq otimizado para humano imune primária células ou seja, CD4 + linfócitos (T helper 1 (Th1) e células Th2). Este protocolo abrangente começa com a colheita da pilha, em seguida, descreve o procedimento molecular da cromatina tagmentation, preparação de amostras para sequenciamento de nova geração e também inclui métodos e considerações para as análises computacionais utilizadas para interprete os resultados. Além disso, para economizar tempo e dinheiro, introduzimos as medidas de controlo de qualidade para avaliar a biblioteca ATAC-seq antes de sequenciamento. Importante, os princípios apresentados neste protocolo permitem sua adaptação ao outro humanas imunes e não imune primária as células e linhas celulares. Estas orientações também será útil para os laboratórios que não são proficientes com métodos de sequenciamento de próxima geração.

O resultado final do presente protocolo é uma biblioteca de ATAC-seq de normalmente 3-20 ng / µ l. Quando executado em um sistema para análise de integridade de DNA (ver Tabela de materiais e equipamentos), eles mostram a escada-como a aparência2 (Figura 3A). O tamanho médio dos fragmentos de DNA é tipicamente ~ 450-530 bp.
Controle de qualidade adequad...

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Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

mapping-genome-wide-accessible-chromatin-primary-human-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

17.9K visualizações.  Bar-Ilan University. Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

Vídeo: Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of associated loci. In addition, the presence of specific modifications has been used to determine the position and identity non-coding functional elements such as enhancers. In recent years, chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) has become a powerful tool in determining the genome-wide profiles of individual histone modifications. However, it has become increasingly clear that the combinatorial patterns of chromatin modifications, referred to as Chromatin States, determine the identity and nature of the associated genomic locus. Therefore, workflows consisting of robust high-throughput (HT) methodologies for profiling a number of histone modification marks, as well as computational analyses pipelines capable of handling myriads of ChIP-Seq profiling datasets, are needed for comprehensive determination of epigenomic states in large number of samples. The HT-ChIP-Seq workflow presented here consists of two modules: 1) an experimental protocol for profiling several histone modifications from small amounts of tumor samples and cell lines in a 96-well format; and 2) a computational data analysis pipeline that combines existing tools to compute both individual mark occupancy and combinatorial chromatin state patterns. Together, these two modules facilitate easy processing of hundreds of ChIP-Seq samples in a fast and efficient manner. The workflow presented here is used to derive chromatin state patterns from 6 histone mark profiles in melanoma tumors and cell lines. Overall, we present a comprehensive ChIP-seq workflow that can be applied to dozens of human tumor samples and cancer cell lines to determine epigenomic aberrations in various malignancies.

Here, we describe an optimized high-throughput ChIP-sequencing protocol and computational analyses pipeline for the determination of genome-wide chromatin state patterns from frozen tumor tissues and cell lines.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Pesquisa do câncer

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible chromatin. In this paper we present an improved ATAC-seq protocol that reduces contaminating mitochondrial DNA reads. While previous ATAC-seq protocols have struggled with an average of 50% contaminating mitochondrial DNA reads, the optimized&#160;lysis buffer introduced in this protocol reduces mitochondrial DNA contamination to an average of 3%. This improved ATAC-seq protocol allows for a near 50% reduction in the sequencing cost. We demonstrate how these high-quality ATAC-seq libraries can be prepared from activated CD4+ lymphocytes, providing step-by-step instructions from CD4+ lymphocyte isolation from whole blood through data analysis. This improved ATAC-seq protocol has been validated in a wide range of cell types and will be of immediate use to researchers studying chromatin accessibility.

Here, we present a protocol to perform an assay for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) on activated CD4+ human lymphocytes. The protocol has been modified to minimize contaminating mitochondrial DNA reads from 50% to 3% through the introduction of a new lysis buffer.

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Genética

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin accessibility profiling. This technique has been useful for understanding the regulatory mechanisms of gene expression in a range of biological processes. Although ATAC-seq has been modified for different types of samples, there have not been effective modifications of ATAC-seq methods for adipose tissues. Challenges with adipose tissues include the complex cellular heterogeneity, large lipid content, and high mitochondrial contamination. To overcome these problems, we have developed a protocol that allows adipocyte-specific ATAC-seq by employing fluorescence-activated nucleus sorting with adipose tissues from the transgenic reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse. This protocol produces high-quality data with minimal wasted sequencing reads while reducing the amount of nucleus input and reagents. This paper provides detailed step-by-step instructions for the ATAC-seq method validated for the use of adipocyte nuclei isolated from mouse adipose tissues. This protocol will aid in the investigation of chromatin dynamics in adipocytes upon diverse biological stimulations, which will allow for novel biological insights.

We present a protocol for assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifically on adipocytes using nucleus sorting with adipose tissues isolated from transgenic reporter mice with nuclear fluorescence labeling.

ATAC-Seq específico de adipócitos com tecido adiposo usando classificação de núcleo ativado por fluorescência

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin ...

CATCH-UP: A High-Throughput Upstream-Pipeline for Bulk ATAC-Seq and ChIP-Seq Data

Assay for transposase-accessible chromatin (ATAC) and chromatin immunoprecipitation (ChIP), coupled with next-generation sequencing (NGS), have revolutionized the study of gene regulation. A lack of standardization in the analysis of the highly dimensional datasets generated by these techniques has made reproducibility difficult to achieve, leading to discrepancies in the published, processed data. Part of this problem is due to the diverse range of bioinformatic tools available for the analysis of these types of data. Secondly, a number of different bioinformatic tools are required sequentially to convert raw data into a fully processed and interpretable output, and these tools require varying levels of computational skills. Furthermore, there are many options for quality control that are not uniformly employed during data processing. We address these issues with a complete assay for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) and chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) upstream pipeline (CATCH-UP), an easy-to-use, Python-based pipeline for the analysis of bulk ChIP-seq and ATAC-seq datasets from raw fastq files to visualizable bigwig tracks and peaks calls. This pipeline is simple to install and run, requiring minimal computational knowledge. The pipeline is modular, scalable, and parallelizable on various computing infrastructures, allowing for easy reporting of methodology to enable reproducible analysis of novel or published datasets.

ATAC-seq and ChIP-seq allow detailed investigation of gene regulation; however, processing these data types is challenging and often inconsistent between research groups. We present CATCH-UP: an easy-to-use computational pipeline that allows standardized and reproducible data processing and analysis of new and published ATAC/ChIP-seq datasets.

Assay for transposase-accessible chromatin (ATAC) and chromatin immunoprecipitation (ChIP), coupled with next-generation sequencing (NGS), have ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

Isolamento de núcleos de células progenitoras cardíacas de camundongos em resolução de célula única

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Autor em destaque: Isolamento de núcleos de células progenitoras cardíacas de camundongos para epigenoma e perfil de expressão gênica em resolução de célula única  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Biologia

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

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