O método do ritmo foi desenvolvido e otimizado por vários membros do grupo de Dupree (Universidade de Cambridge, UK) ao longo dos anos, e agradecemos todas as suas contribuições. Este trabalho foi financiado no âmbito do Instituto de bioenergia comum DOE (http://www.jbei.org) suportado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de biológicos e investigação ambiental, através de contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Laboratório nacional de Berkeley e o departamento de energia dos EUA. Agradecemos também Thea Pick e Vy Ngo para ajuda com a preparação das amostras de csla9 .

1. colheita de Material vegetal <ol><li>colher material de planta fresco (~ 20 mg) e, imediatamente, submirja em etanol a 96% (v/v) e incubar a 70 ° C por 30 min; isto desativa qualquer parede celular presentes enzimas degradantes. Para material seco, comece pela etapa 2. 
	Cuidado: O álcool etílico é inflamável. 
	Nota: Uma única folha de haste ou Roseta irá fornecer material suficiente para análise. No entanto, menos erros surgirem se uma maior quantidade de tecido é agrupada e analisada desde que isto é mais fácil para pesar e lidar com.</li>
	<li>Registrar cuidadosamente o tipo de tecido e grau de desenvolvimento, como estrutura de polissacarídeo varia com os dois. Por exemplo, com Arabidopsis thaliana (usado aqui), fase o tecido de acordo com os métodos de Boyes et al 15 Nota: Este protocolo, usamos a metade inferior da haste da inflorescência, onde a primeira síliqua é totalmente alongada mas não amarelamento.</li></ol>
 2. preparação de álcool insolúvel resíduo (ar) <ol><li>preparar ar, seguindo o método de Mortimer et al 9 ou outro método semelhante, a fim de produzir um pó falta de açúcares solúveis, como sacarose e amido.</li>
</ol> 3. Alíquotas e pré-tratamento de ar Nota: A quantidade exata de ar necessária para cada amostra dependerá do (a) a abundância do polissacarídeo de interesse no material e (b) o tamanho médio dos oligossacarídeos, lançado pela o GH. O método adiciona uma molécula fluorescente ao final de cada oligossacarídeo, reduzindo assim o número de oligossacarídeos determina a sensibilidade do experimento. Como uma diretriz, para glucomannan no tronco de Arabidopsis digerido com GH5/GH26 (como descrito), 500 µ g é recomendado 11, Considerando que para xilana em tronco de Arabidopsis digerido com GH11, recomenda-se 100 µ g como em Mortimer &#39; estudo s 3. <ol><li>pesa ar (10-15 mg) em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar H 2 O a uma concentração final de 2 mg/mL. Vórtice para conseguir uma suspensão mesmo. Se isto é problemático, usar um homogeneizador de vidro para ajudar neste processo.</li>
	Tubos <li>alíquota 500 µ g em microcentrífuga. Alíquotas utilizando uma centrífuga a vácuo a seco (veja a Tabela de materiais) durante a noite em 30 ° C.</li>
	<li>Pré-tratamento de ar com 1 M de NaOH (20 µ l) por 1h à temperatura ambiente; isto de acetylates os polissacarídeos e incha as microfibrilhas de celulose, rompendo a estrutura de biomassa e permitindo o acesso de GH. 
	Nota: Este passo pode ser ignorado para polissacarídeos purificados. Cuidado &#8211; ácido/base forte.
	<ol><li>Incluem uma alíquota para um controle de ar não-enzimática (tratados da mesma forma como todas as amostras, exceto passo 4.1. é excluído).</li>
	</ol></li> <li>Adicionar 200 µ l de H 2 O e 20 µ l 1m HCl para neutralizar. Teste que o pH é ~ 6-7, removendo 1 µ l e mancha-lo em tiras de papel indicador de pH.</li>
	<li>De amónio de 1m adicionar 50 µ l de tampão de acetato, pH 6.0 (ou qualquer que seja o pH é apropriado para o GHs utilizado no estudo) e H 2 O para dar um volume total de 500 µ l. 
	Nota: Acetato de amônio é usado desde que sublima-se após a secagem, e então não adiciona sal adicional à amostra. Um excesso de sal pode levar a banda-forma pobre e resolução sobre o gel ritmo.</li>
</ol> 4. Hidrólise do ar com Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: como mencionado na discussão, a pureza do GHs é crítica. Use somente heterologously expressado, afinidade purificado de enzimas. Após o recebimento de cada lote do fabricante, hidrolisar alíquotas definidas de substrato (por exemplo, 500 µ g ar) com o aumento da quantidade de GH durante a noite (por exemplo, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unidades / µ l). Quando há um excesso de GH, a impressão digital ritmo vai olhar idêntico. Um excesso de enzima é necessário para entregar um resultado reprodutível, porque deve estar certo de que a reação de hidrólise aproxima-se o ponto de extremidade.
Controle <ol><li>Adicionar uma quantidade pré-determinada (veja acima), de mannanases (GH5 e GH26 11) para as alíquotas de ar no buffer da etapa 3.5, bem como um positivo (30 µ g de glucomannan konjac) e um controle negativo não-ar (mistura de enzima em um tubo vazio). Vórtice e em seguida girar brevemente para recolher a mistura de reação no fundo do tubo.</li>
	<li>Incubar durante uma noite a 37 ° C (ou a temperatura apropriada para o GH de escolha), com agitação suave (~ 100 rpm).</li>
	<li>Parar a reação incubando a 95 ° C por 20 min. 
	Nota: Tampas de Cap podem ser usadas para selar os tubos de microcentrífuga flip-top.
	<ol><li>Centrífuga usando uma microcentrífuga de bancada superior na velocidade máxima por 10 min e reter sobrenadante.</li>
	</ol></li> <li>Resuspenda o pellet em 250 µ l H 2 O, centrífuga como acima e reter sobrenadante.</li>
	<li>Combinar ambos os sobrenadantes e seque em uma centrífuga a vácuo (veja a Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 3 h ou durante a noite sem aquecimento).</li>
</ol> 5. Elaboração de normas Oligosaccharide <ol><li>estoque de 1 mM de preparar soluções em H 2 O da manose (homem), mannobiose (homem 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (homem 4), mannopentaose (homem 5) e mannohexaose (homem 6), todos os β, 1-4 ligados. Alíquota e loja a-20 ° C até necessário.</li>
	<li>Preparar 3 diferentes concentrações de um homem mistura de 1-6, combinando 1 µ l (padrão S1), 2 µ l (S2) ou 5 µ l (S3) de todos os seis.</li>
	<li>Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization de oligossacarídeos <ol><li>Prepare uma solução stock de formigas de 0,2 M (ácido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonic) em H 2 O: ácido acético 17:3. Estoque quente a 60 ° C para dissolver completamente o sólido. Loja a-20 ° C, protegido da luz, por 2-3 meses.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de 0,2 M de 2-picolina borano (2-PB) em DMSO. Isto é extremamente higroscópico, resuspenda então imediatamente todo o pó em cima do recibo em DMSO. Alíquota e loja a-20 ° C durante 1-2 anos. Descongelar as alíquotas como necessária (loja a 4 ° C, durante 2 semanas e em seguida descarte).</li>
	<li>Preparar o buffer de derivatização de H 2 O: ácido acético: DMSO às 17:03:20.</li>
	<li>Para cada amostra, adicionar 5 µ l de formigas, 5 µ l de 2-PB e 10 µ l de tampão de derivatização. Spin brevemente para coletar no fundo do tubo, vórtice completamente e em seguida girar rapidamente novamente. Veja a Figura 1 para descrição de reação.</li>
	<li>Amostras de incubar durante a noite a 37 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 2 h).</li>
	<li>Ressuspender amostras e padrão em ureia de 3M 100 µ l. Loja a-20 ° C, protegida da luz até necessária.</li>
</ol> 7. Gel de preparação do ritmo Nota: montagem do equipamento de fundição de gel vai depender da marca. Aqui, nós use um sistema de eletroforese vertical (ver Tabela de materiais), equipado com placas de vidro de 18 x 24 cm e 1,5 mm espaçadores.
<ol><li>Montar equipamento de fundição de gel pelo fabricante &#39; instruções de s.</li>
	Buffer de ritmo <li>make x 10 (1 M Tris-borato pH 8,2) como segue: Adicionar 121,14 g de Tris-Base a ~ 400 mL de H 2 O e misture para dissolver. Ajustar o pH a 8.2 por adição de ácido bórico sólido (cerca de 60 g) e em seguida fazem o volume até 1 L.</li>
	<li>Fazer um 10% (p/v) de amônio persulfato (APS) estoque em H 2 O. alíquota e armazenar em alíquotas de degelo-20 ° C. uma vez, armazenar a 4 ° C e descartar depois de 2 semanas.</li>
	<li>Fazer e despeje o gel de resolução. Para os equipamentos acima, 1 gel equivale a 50 mL. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture H 2 O (20,2 mL), 5 mL x 10 ritmo de tampão, 24,6 mL 40% acrilamida/Bis-acrilamida (29:1 acrylamide:Bis). (Atenção: tóxico).
	<ol><li>Adicionar 200 µ l de APS e 20 µ l de N, N, N, N´-tetrametil-etilenodiamina (TEMED). Inverta suavemente para misturar (para evitar a introdução de bolhas de ar). Despeje o gel usando um serológicos ou outra pipeta de grande volume, a ~ 4 cm abaixo do topo das placas de vidro. Preste atenção para a possibilidade de ficar preso no gel de bolhas de ar. Se eles fazer, parar de derramar e inclinação/torneira o gel para soltá-los.</li>
	</ol></li> <li>Sobrepor o gel com isopropanol (inflamável de precaução :) ou, cuidadosamente, com H 2 Allow O. gel para polimerizar (20-30 minutos) e, em seguida, despeje a camada superior. Se isopropanol foi usado, em seguida, lave 2 x com H 2 O. Dry qualquer excesso de líquido usando papel mata-borrão.</li>
	<li>Fazer e despeje o gel de empilhamento. Misture 6,8 mL H 2 O, 1 mL de tampão de ritmo x 10, 2,8 mL acrilamida/Bis-acrilamida (PRECAUÇÃO: tóxico), 80 µ l APS e 8 µ l de TEMED em um tubo de centrífuga de 15 mL. Inverter para misturar e sobrepor em cima do gel de resolução polimerizado. Introduza cuidadosamente os pentes, evitando armadilhas bolhas de ar sob os dentes do pente.</li>
	Gel de <li>permitir a polimerizar (20-30 min), embrulhe em tecido úmido e em seguida em filme plástico e armazenar a 4 ° C até necessária. Loja com os pentes no lugar. 
	Nota: Ritmo géis podem ser armazenados por um período máximo de 2 semanas (embora menos de 1 semana é o ideal), se eles são mantidos húmidos.</li>
</ol> 8. Executando um ritmo Gel <ol><li>usar um marcador permanente para rotular as posições bem no vidro, que ajudarão a manter o controle de ordem de carregamento, e na identificação de onde os poços são uma vez que o pente é removido.</li>
	<li>Remover o pente. Encher os poços com buffer de ritmo 1 x.</li>
	<li>Usar um 10 µ l micro-seringa carregar 2 µ l de padrões e amostras em poços. Evite usar as pistas mais externa, que tendem a executar amostras mal.</li>
	<li>Montar a câmara superior do aparato gel de execução e colocar o gel em um tanque de refrigeração (~ 10 ° C) execução (10 ° C), contendo 1 x ritmo buffer. Encha a câmara superior com buffer de ritmo 1 x.</li>
	<li>Ligue o poder e executar o gel a 200 V (constante V) por 30 minutos e depois aumento da tensão de 1000 V para 1 h 40 min. Proteger os geles de luz (por exemplo, envolvendo tanques em sacos de lixo preto). 
	Nota: Verificar os géis ~ 5 min depois de ligar a tensão e depois mais 5 min. depois de um aumento da tensão de 1.000 V. Se a bateria é incapaz de manter a tensão, então provavelmente existe um vazamento de reserva. Remova o gel do tanque. Volte a montar a câmara superior, cuidadosamente verificando o posicionamento de todas juntas. Um chip grande na borda superior da placa de vidro pode impedir a placa formando uma boa vedação com a junta. Isso geralmente pode ser temporariamente resolvido adicionando uma gota de agarose fundido de 5% (p/v) para a parte lascada do vidro, antes de adicionar a câmara superior.</li>
</ol> 9. Visualizando um gel de ritmo Nota: Use um gel sistema equipado com lâmpadas de UV de ondas longas no transiluminador e um filtro de emissão para a câmera que é apropriado para o fluoróforo, aqui 530 nm de imagem. Alternativamente, um scanner a laser também pode ser utilizado, conforme descrito em Goubet 2.
<ol><li>Certifique-se de gel sistema de imagem é livre de poeira, limpando-a com tecido úmido fiapos.</li>
	<li>Remover o gel do tanque de ritmo e ver os brevemente, enquanto que o gel é ainda nas placas de vidro (&#60; 80 ms) para determinar se a frente de tintura é ainda no gel.</li>
	<li>Abrir o gel usando uma ferramenta de cunha e enquanto o gel é ainda na placa de um vidro, use um cortador de pizza para remover tanto o gel de empilhamento e, se a frente de tintura é ainda no gel, parte inferior do gel.</li>
	<li>Coloque a superfície do transiluminador ~ 5 mL H 2 O e depois transferir o gel diretamente sobre o transiluminador. Definir o filtro de UV 605 e ative o transiluminador UV de ondas compridas (ver Tabela de materiais) usando o software. 
	Nota: O formigas fluoróforo usado aqui tem uma excitação/emissão de 353/520 nm.</li>
	<li>Tirar várias fotos em vários tempos de exposição (por exemplo, 100 ms a 10 s). Certifique-se de que a luz UV é desligada entre imagens clicando no botão de luz de UV (para desligá-lo) para evitar a degradação da fluorescência. Garantir que pelo menos 2 das imagens não saturadas bandas (o gel software de imagem irá indicar isto).</li>
	<li>Salve arquivos como imagens de alta-resolution.tif. 
	Nota: Imagens podem ser analisadas usando o software fornecido com o sistema de imagem de gel, ou usando o software de análise de imagem livremente disponíveis, tais como ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Consulte a seção de resultados para uma discussão de quantificação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. 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Os autores não têm nada para divulgar.

RITMO é um método simples para caracterizar a estrutura de polissacarídeos. Pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem conhecidas GHs com atividade caracterizada, ver inúmeros exemplos na literatura1,6,9,11. TT também foi aplicado para a caracterização do romance GHs12,13,18 e glycosyltransferases9, fazendo uso de substratos de polissacarídeo definidos e aceitadores.
Resultados reprodutíveis, interpretáveis são dependentes em três etapas-chave. Primeiro, o GHs usado deve ser livre de contaminar as atividades. Isto é melhor alcançado usando apenas heterologously expressa, afinidade purified enzimas. Em segundo lugar, para a maioria dos experimentos, é importante que a hidrólise enzimática de substratos é na conclusão. Isso garantirá que a mesma biomassa hidrolisada com o GH mesmo dá a mesma impressão em cada experimento. Finalmente, deve haver um excesso de fluoróforo na reação de derivatização. Isso garante que as extremidades reduzindo disponíveis são rotuladas em perto de 100%. Isso resultará em alta reprodutibilidade dos resultados, bem como os dados quantitativos.
Gel e reagente de qualidade são essenciais para garantir os dados podem ser reproduzidos. Buffers de má qualidade, especialmente de pH incorreto, bolhas no gel de ar, e amostras com excesso de sal podem todos afetam fator resolução e retenção dos oligossacarídeos. No entanto, inclusão dos controles recomendados descritos na seção de protocolo e resultados permitirá solução de problemas.
RITMO é limitado pela sua capacidade de identificar oligossacarídeos. Para algumas experiências, uma impressão digital simples é tudo que é necessário. Contudo, para verdadeiramente dosar a quantidade de glucomannan em uma amostra de ar, por exemplo, a identidade de todos os oligossacarídeos lançados seja necessária, que é um processo demorado. Isto é mais simples para menos polissacarídeos complexos como xilana3. Uma vez que existem alguns padrões de oligossacarídeo comercialmente disponível, pode não ser sempre possível ou desejável para identificar todas as bandas. Neste caso, o ritmo pode fornecer dados muito elogioso para espectrometria de massa (ou seja, MALDI-CID9 ou ESI-MS7e NMR6). Para esses métodos, muitas vezes é útil fazer uma preparação em grande escala, separados por cromatografia de exclusão de tamanho e em seguida analisar cada fração por ambos ritmo antes da MS ou NMR. Enquanto tem sido relatado que bandas podem ser extirpadas e identificadas por MALDI-CID, na prática, constatámos que isso tem uma baixa taxa de sucesso (possivelmente devido a interações dos oligossacarídeos, etiquetados com o gel do acrilamido quando exposto à luz UV).
A outra limitação importante do ritmo é a taxa de transferência. Para ter boa qualidade, géis interpretáveis com os controles apropriados, cada gel terá somente ~ 10 amostras experimentais, e um pesquisador pode esperar para executar géis de ritmo ~ 4 por dia. Recentemente, uma versão do ritmo utilizando eletroforese capilar (CE) tem sido desenvolvido,19, que permite a preparação de amostras em placas de 96 poços. Ele tem sido usado com sucesso para caracterizar as atividades de enzima glycosyltransferase e polissacarídeo estruturas6,19, ainda requer acesso a uma máquina de CE, o que pode ser caro para comprar e manter.

Polissacarídeo análise por eletroforese em gel (PACE) é um método para a caracterização detalhada dos polissacarídeos1,2,3. Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros.
Estrutura de polissacarídeos da parede celular de plantas compreensão é necessária que os pesquisadores explorando a biossíntese da parede celular de planta ou o papel de parede da célula vegetal no desenvolvimento da planta. Recentemente, no entanto, composição de parede celular planta tornou-se interessante para um grupo maior de pesquisadores devido o foco sobre o uso de biomassa vegetal (essencialmente a parede celular) como uma matéria-prima para produzir biocombustíveis e bioquímicos4. Como exemplo, sacarificação enzimática eficiente deste material requer um entendimento detalhado das estruturas polissacarídeo, para que otimizado coquetéis enzimáticos podem ser selecionados5.
RITMO tem várias vantagens sobre métodos alternativos que o tornam ideal para a análise rápida de estruturas complexas glicano. Em primeiro lugar, não requer purificação do polissacarídeo em questão, como é necessário para a solução de ressonância magnética nuclear (NMR) estado6. Em segundo lugar, o ritmo pode resolver isómeros estruturais, ao contrário de espectrometria de massa (MS, por exemplo, assistida por matriz laser dessorção/ionização (MALDI) e ionização electrospray (ESI)), que também pode ser um desafio para executar por cromatografia líquida (LC) 7. em terceiro lugar, o ritmo é muito sensível, com resolução baixa-picomole, ao contrário da cromatografia de camada fina (TLC) ou a cromatografia em papel. Finalmente, não exige conhecimento caro de equipamento ou especialista, como é o caso de MS, NMR e LC.
O método de ritmo depende da especificidade da glycosyl hydrolase (GH) enzimas, que têm como alvo certas ligações glicosídicas em uma mistura de polissacarídeos. Quando a enzima GH atua na cadeia de polissacarídeo, revela um redução final que pode então ser quimicamente derivatizado, neste caso com uma etiqueta fluorescente. A mesmo porção da amostra é processada portanto indetectável por esse método. Oligossacarídeos etiquetados são então separados em um gel do acrilamido do grande-formato por eletroforese. Isso dá excelente resolução de moléculas muito semelhantes, por exemplo, os trissacarídeos Glc-homem-homem e homem-Glc-Glc terá um diferente Rf.
RITMO tem sido amplamente utilizado para caracterizar estruturas de xilana diferentes em toda a espécie de planta8, para identificar os mutantes glycosyltransferase em Arabidopsis6,9,10,11 , para realizar ensaios de glycosyltransferase9e para caracterizar o romance GH atividades12,13. Recentemente, também usamos isso para caracterizar Medeiros de parede celular de levedura (Mahboubi e Mortimer, em preparação). Aqui nós descrevemos um método para caracterizar a estrutura de glucomannan da parede celular vegetal, com base em anteriores relatórios11,14.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Oligosaccaharide Standards&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other specialty chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picoline borane</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialty Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel casting kit</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td></tr><tr><td>Cooling recirculating water bath&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td></tr><tr><td>High Voltage Power Pack</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Glycosyl hydrolases&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lab supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging software ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros. Para análise de polissacarídeo por eletroforese em gel (PACE), material de parede celular vegetal é hidrolisado com glycosyl hidrolases específicas para o polissacarídeo de interesse (por exemplo, mannanases de Medeiros). Géis de poliacrilamida de grande formato são usados para separar lançados oligossacarídeos, que tem sido rotulados fluorescente. Géis podem ser visualizados com um gel modificado sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais). Digitais de oligossacarídeo resultante também podem ser comparadas qualitativamente ou, com replicação, quantitativamente. Enlace e ramificação de informações podem ser estabelecidas usando hidrolases glycosyl adicionais (por exemplo, mannosidases e galactosidases). Enquanto este protocolo descreve um método para analisar a estrutura de glucomannan, pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem glycosyl caracterizadas hidrolases. Alternativamente, pode ser usada para caracterizar o romance glycosyl hidrolases utilizando substratos de polissacarídeo definidos.

Aqui, nós mostramos um gel de ritmo de exemplo executado por protocolo, juntamente com descrições para ajudar com a interpretação de dados e solução de problemas, e este é seguido por um guia geral para sucesso ritmo gel de interpretação13,16. Um gel representativo de um ritmo padrão ensaio do conteúdo de parede celular Medeiros é mostrado na Figura 2e é descrito a faixa por faixa.
Normas Faixas 1, 2 e 3 mostram uma escada de oligossacarídeos adquiridos comercialmente (homem1- homem6) em 5 (S1), 10 (S2) e 50 (S3) pmol concentração. Ao receber um lote novo de um oligossacarídeo comercial, é importante verificar a pureza em um gel. Muitos oligossacarídeos, particularmente tetrasacccharides e mais, pode ter uma contaminação significativa com oligossacarídeos de outros graus de polimerização (DPs), como mostrado aqui para homem6 (marcados com *). Enquanto dosar um gel, é importante ter pelo menos 3 concentrações dos padrões, uma vez que é necessário para calcular a curva padrão. Cálculo da curva padrão também pode ser útil para garantir que a reação de derivatização é essencialmente na conclusão. Padrões de concentrações conhecidas permitem comparações entre géis e são um controle útil para separação de qualidade e qualidade de derivatização.
Controlo positivo Lane 4 mostra uma digestão mananase de glucomannan konjac. Glucomannan konjac é disponível comercialmente, e enquanto não tem a mesma estrutura que, por exemplo, encontrados em Arabidopsis, serve dois propósitos. Em primeiro lugar, é um controle importante para a digestão enzimática. O pesquisador deve estabelecer como um substrato comercial digerido com seus GHs de escolha parece quando digerido a conclusão (ou seja, um grande excesso de GH é adicionado para a reação). Se no futuro as experiências altera o padrão, isso pode indicar uma perda de atividade ou contaminação da unidade populacional de GH. Em segundo lugar, ele serve como um controle para a reação de derivatização na presença de sais de enzima e o tampão. Se as normas de boas aspecto, mas o controle positivo é pobre, então isso pode indicar que um componente da reação de hidrólise é inibitório para a derivatização.
Haste de Arabidopsis tipo selvagem (WT) ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) 5 Lane mostra a impressão digital de ritmo de um tronco de Arabidopsis WT (compare com referências11,14).
csla9 Haste de Arabidopsis ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) 6 Lane mostra mostra a impressão digital de ritmo da haste de um Arabidopsis plantar falta o major Medeiros sintase11-tronco. Compare o WT e controlo negativo impressões digitais. Enquanto a maioria do Medici está ausente nesta fábrica, permanece uma quantidade pequena, como evidenciado pelas intensidades de banda reduzida para todos os derivados de mananase oligossacarídeos isto é sintetizado pelas sintases Medeiros adicionais (CSLA2, 3)11.
Controle negativo - enzima apenas 8 Lane mostra bandas no gel que não são específicas de que derivam dos contaminantes o mananase cocktail e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Controle negativo - WT somente AIR 9 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Controle negativo- csla9 Somente AIR 10 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Pinho de madeira ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) Lane 7 mostra a impressão digital de ritmo de madeira de pinho, que contém galactoglucomannan. Isto claramente tem um padrão diferente de oligossacarídeos liberados de Arabidopsis, devido à sua estrutura diferente.
Controle negativo - pinho somente AIR Lane 11 mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Interpretar um gel de ritmo é relativamente simples, mas requer a conscientização dos pontos seguintes. De dados robusto, é recomendável efectuar ritmo pelo menos 3 independentemente crescido biológica Replica, e recomenda-se realizar pelo menos 2 repetições de técnicas em cada replicar biológica. Os controles descritos são essenciais para a interpretação, como faixas não específicas devam ser excluídos. Também recomendamos carregar amostras em uma ordem diferente em replicar geles, para excluir os efeitos que resultam de iluminação desigual pelo transiluminador. Exata interpretação requer análise das bandas que não estão saturados. Como algumas impressões de oligossacarídeo podem conter ambos os polissacarídeos abundância muito alta e baixa, recomendamos analisar várias exposições do gel mesmo. Os padrões podem ser usados para normalizar entre diferentes imagens.
Para alguns tipos de experimentos, pode ser desejável para quantificar a quantidade de polissacarídeo em preparação o ar. Enquanto é possível quantificar de um gel de ritmo, exige o conhecimento da identidade molecular exata de cada oligossacarídeo lançado pelo GHs e onde ele está localizado no gel o ritmo. Isso atualmente não é totalmente conhecido por Medeiros, mas foi determinado para outros polissacarídeos , por exemplo, xilana3. Os padrões fornecem uma maneira de normalizar entre géis, mesmo quando a quantificação não está sendo executada e assim ajudará em qualquer análise qualitativa ou semi-quantitativa.
Identificar a estrutura de oligossacarídeos individuais pode ser conseguido usando coquetéis de GHs. Sequential adição de mais GHs pode revelar detalhes sobre o estabelecimento de vínculos e substituições dos oligossacarídeos liberados (por exemplo, adição de β - 1,4 - glicosidase que age na extremidade não redutora irá revelar quais oligossacarídeos na mistura contenham esse recurso). As enzimas disponíveis incluem galactosidases, glucuronidases e glucosidases (consulte o banco de dados CAZy16 para obter informações adicionais); Ver Hogg, d. et al . 17 como exemplo.
O protocolo acima pode ser usado para caracterizar a atividade do GHs desconhecidos. Neste caso, uma biomassa definida, tais como Arabidopsis haste ou konjac glucomanano, deve ser usada para a tela o GHs desconhecido13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Figura 1 : Isto mostra o esquema para o fluorescente derivatização de oligossacarídeos com formigas. Modificado da Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"target = blank" &gt; clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Figura 2 : Gel de ritmo representativo mostrando a impressão digital Medeiros de Arabidopsis, pinheiros e um mutante de Arabidopsis (csla9) que tem comprometido a biossíntese de Medeiros. AlR foi hidrolisada com um cocktail de mananase e oligossacarídeos liberados foram derivatizados com um fluoróforo. Os oligossacarídeos foram separados por eletroforese em gel com base no tamanho, forma e carga. Uma escada de manno-oligossacarídeos (Man1-6) é mostrada para ajudar a identificar mobilidades relativas dos oligossacarídeos, lançados, e uma hidrólise de Medeiros purificado (derivado de konjac) é mostrada como um controle positivo. * = faixas não específicas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K visualizações.  Joint BioEnergy Institute. Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

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Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Bioquímica

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Química

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte II: Os hidratos de carbono

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Biologia

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Biologia do Desenvolvimento

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

Determinação da distribuição do comprimento da cadeia glucano do glicógeno usando o Método de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Elucidando a estrutura e a ocorrência de glicanos usando o perfil de polímero de microarray

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Autor em destaque: Protocolo MAPP - Avançando na análise de glicanos 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...