Agradecemos o dom dos FDAAs usado na Figura 2 e Figura 4-Michael VanNieuwenhze (Universidade de Indiana). Agradecemos a membros do laboratório marrom para feedback durante a preparação deste manuscrito. Pesquisa no laboratório de marrom na divisão e crescimento de células da . tumefaciens é suportada pela National Science Foundation (IOS1557806).

1. crescimento de cepas da . tumefaciens
<ol><li>
Cultivo de cepas da . tumefaciens
	<ol>
<li>Use uma ponta de madeira estéril da vara ou pipeta para inocular 1 mL de meio de crescimento ATGN (ver lista de materiais para a receita) com uma única colônia da estirpe desejada. Nota: Para as estirpes de depleção da . tumefaciens , o ATGN deve conter 1 mM IPTG como um indutor para manter a biossíntese da proteína essencial.</li>
		<li>Crescem as cepas da . tumefaciens pernoite em ATGN a 28 ° C, com agitação a 225 rpm.</li>
		<li>Medir a densidade óptica das células em 600 nm (OD600), utilizando um espectrofotômetro. Diluir a cultura de pilha para uma OD600 = ~0.2 e continuar a crescer até OD600 = ~0.6 é alcançado. Para cepas de depleção, continuar a crescer com indutor até OD600 = ~0.6 é alcançado.</li>
		<li>Use sua e mutante cepas da . tumefaciens em OD600 = ~0.6 para mancha alvo-específica e/ou microscopia de lapso de tempo (ver as seções 2 e 3.1). Para cepas de depleção, lavar o indutor (ver ponto 1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Remoção de indutor para caracterização de cepas de depleção de proteína a. tumefaciens
	<ol>
<li>1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga desktop à temperatura ambiente.</li>
		<li>Para lavar, remover o sobrenadante e resuspenda o pellet em mídia fresca sem indutor da pelota e as células conforme descrito acima (1.2.1). Lave as células de um total de 3 vezes na nova mídia.</li>
		<li>Resuspenda o pellet final na mídia fresca e concentrar-se as células de uma OD600 = ~0.8 para coloração imediata com corantes específicos do alvo (secção 2 e Figura 4B-D) ou microscopia de lapso de tempo ( Figura 4Ae seção 3.2) . Alternativamente, pre-empobrecem as células para a quantidade de tempo desejada pelo crescimento de células em meios sem indutor antes da coloração e da imagem latente das células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. destino-específicos de coloração de células da . tumefaciens
<ol><li>
Parede celular d-amino ácido de fluorescente rotulagem Nota: FDAAs são tóxicos fluorescentes d-aminoácidos prontamente incorporadas o . tumefaciens peptidoglicano. Este procedimento simples rotulagem sondas crescimento padronização em células vivas6. Protocolos para a síntese de quatro FDAAs estão disponíveis38.<ol>
<li>500 µ l de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho. Resuspenda o pellet de células em 100 µ l de mídia fresca.</li>
		<li>Adicione 5 µ l de 5mm FDAA para lavado e concentrado de células e incuba por 2 min no escuro. Nota: Limitar a exposição à luz FDAA. O tempo de incubação irá variar dependendo da taxa de crescimento da tensão. Normalmente, tempos de incubação devem ser de 5-10% do tempo dobrando6.</li>
		<li>Pelotas as células por centrifugação e lavar pelotas de célula com solução salina tamponada fosfato (PBS) três vezes.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em ~ 50 µ l PBS. Nota: O volume de PBS usado para ressuspensão pode variar com base no tamanho da pelota.</li>
		<li>Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente (ver secções 3.1 e 3.2).<ol>
<li>Como alternativa, pare mais incorporação de rótulo, fixando as células com etanol a 70% gelado. Ressuspender as células em 1 mL de etanol a 70% gelado e incubar no gelo por 15 minutos.</li>
			<li>Coletar as células por centrifugação e Resuspenda em um pequeno volume de PBS para a imagem latente em um momento posterior. Loja de suspensões celulares a 4 ° C e imagem dentro de 48 horas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA de coloração com DAPI ou mancha laranja Nota: Observar DNA estrutura, as células são rotuladas com DAPI ou laranja (mancha de célula morta). Embora classicamente descrita como uma "mancha de mortos-célula", o laranja é permeant, fotoestável e não afeta o crescimento de células bacterianas, permitindo viver-pilha DNA imagem10. Em a. tumefaciens, laranja rotulagem funciona bem em células vivas e é adequada para microscopia de lapso de tempo (Figura 3). Em contraste, o ultravioleta (UV) luz ambiente necessário para células de imagem manchada de DAPI é fototóxico (Figura 3) e assim DAPI coloração é o mais adequado para a coloração de células vivas para imediata de imagem ou manchando pilhas fixas.<ol>
<li>DAPI coloração de células<ol>
<li>1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho.</li>
			<li>Opcionalmente, para corrigir as células antes da coloração, resuspenda o pellet de células em 1 mL de etanol a 70% gelado. Incube no gelo por 10-15 min.. coletar as células por centrifugação como descritas em 2.2.1.1.</li>
			<li>Ressuspender as células em 1 mL de PBS contendo 1 µ l de solução-mãe de DAPI (1 mg/mL; Veja a Tabela dos materiais). Misture suavemente pipetando e incubar durante 5 minutos no escuro.</li>
			<li>Células de pelotas por centrifugação a 7.000 x g durante 5 min e ressuspender em 1 mL de PBS para remover o excesso DAPI. Lavar as células mais duas vezes e resuspenda o pellet em 50 µ l PBS ou mídia.</li>
			<li>Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente. Consulte as seções 3.1 e 3.2. Nota: Este protocolo não é ideal para microscopia de lapso de tempo observar a dinâmica do cromossomo (Figura 3). Considere o uso de coloração laranja como alternativa (ver secção 2.2.2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloração laranja de células vivas</li>
		<li>1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS contendo 1 µ l de solução-mãe de laranja (veja a lista de materiais). Misture suavemente pipetando e incubar durante 5 min no escuro.</li>
		<li>Células de pelotas por centrifugação e ressuspender em 1 mL de PBS para remover excesso laranja. Lavar as células mais duas vezes e resuspenda o pellet em 50 µ l PBS.</li>
		<li>Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente. Consulte as seções 3.1 e 3.2. Nota: Este protocolo funciona bem com células vivas e é adequado para microscopia de lapso de tempo observar a dinâmica do cromossomo (Figura 3). Se não for conveniente para a imagem imediatamente, as células podem ser fixadas em etanol a 70% gelada (consulte a seção 2.2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de membrana Nota: A tintura fluorescente lipofílico styryl 4-64 tem sido amplamente utilizada para observar a membrana das células bacterianas. Em contraste com muitas bactérias, 4-64 rotulado a. tumefaciens células não rotular uniformemente, mas prefiro frequentemente exibem um padrão de "ferradura"14,15. Notavelmente, o polo de crescimento é quase desprovido de mancha, enquanto que o antigo poste intensamente é rotulado. Assim, 4-64 permite a visualização de ambos os padrões de crescimento celular e a estrutura da membrana na . tumefaciens.<ol>
<li>Adicionar FM 4-64 para uma concentração final de 8 µ g/mL em 1 mL de cultura de células de fase exponencial e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos no escuro.</li>
		<li>Pelota pilhas etiquetadas por centrifugação a 7.000 x g durante 5 minutos em uma centrífuga de área de trabalho e resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS. Lave as células de um total de três vezes para remover o corante em excesso.</li>
		<li>Ressuspender as células em um pequeno volume de PBS e local sobre uma almofada de agarose a imagem imediatamente. (Consulte as seções 3.1 e 3.2) Atenção: As células devem ser fotografadas imediatamente para observar padrões característicos de rotulagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. imagem latente da . tumefaciens células
<ol><li>
Preparação de almofada de agarose Nota: Figura 1 contém uma sequência de imagens (painel A) e esquema (painel B) de uma almofada de agarose típicos preparada para microscopia de lapso de tempo. Almofadas de agarose são tipicamente preparadas conforme necessário.<ol>
<li>3.1.1. use uma lamela como guia e corte uma 22 x 22 mm quadrada do laboratório de cinema (veja lista de materiais) executando um bisturi em torno das bordas.</li>
		<li>Corte um quadrado do centro do filme laboratório deixando um ~ 2-5 fronteira mm para servir como uma junta para a almofada de agarose. Descarte o recorte do centro.</li>
		<li>Coloque a gaxeta do filme numa lâmina de vidro (75 x 25 mm) limpada com uma amônia e líquido de limpeza sem álcool (ver lista de materiais) e aqueça até que o filme é ligeiramente derretido sobre vidro (imagem superior na figura 1A). Para derreter o filme do laboratório, use a borda de um bloco de calor conjunto a 70 ° C ou derreter levemente sobre uma flama.</li>
		<li>Preparar a solução de agarose misturando ~0.075 g agarose (veja a lista de materiais) em 5 mL de mídia em um pequeno frasco. Aqueça a solução em um microondas com agitação periódica para misturar até que a agarose é dissolvido e a solução é clara. Manter a solução de agarose em 55-70 ° C e usar para construção de várias almofadas de agarose em 48 horas.</li>
		<li>Pipeta de mídia contendo 1,2-1,5% de agarose no centro da gaxeta. Nota: O volume de mídia é tipicamente 50-60 µ l mas irá variar com base no tamanho da gaxeta. Adicionando mídia a um slide frio pode causar o agarose solidificar demasiado rapidamente, assim o slide deve ser mantido sobre uma superfície quente. A borda de um bloco de calor bem definido para obras de 70 ° C. Agarose de água ou soluções de agarose em buffer como salina tamponada fosfato (PBS) podem ser usadas em vez de mídia contendo agarose para aplicações em que o crescimento contínuo da célula não é necessário. Para cepas de depleção de imagem, pode ser indutor de presentes ou ausentes na mídia. Presença do indutor pode ser usada como um controle, Considerando que a ausência de indutor irá revelar o fenótipo de depleção.</li>
		<li>Coloque uma lamela sobre a gaxeta para distribuir uniformemente o agarose.</li>
		<li>Coloque slide sobre uma superfície fresca, nível para solidificar por ~ 2 min. Evite excessos da agarose almofada, pois isso resultará em uma superfície enrugada sobre a almofada de agarose e pool de suspensão de célula quando aplicados à superfície.</li>
		<li>Deslize cuidadosamente a lamela a esponja de agarose. Atenção: Não se apresse este passo. A almofada de agarose pode facilmente rasgar e uma almofada de agarose desigual pode dificultar a imagem latente.</li>
		<li>Permitir que a almofada de agarose ao ar seco para 1-2 min à temperatura ambiente até que a superfície da almofada parece seca. Usando um bisturi, remover uma pequena faixa de agarose para criar uma bolsa de ar (meio imagem, figura 1A); a bolsa de ar é tipicamente ~ 2 x 7-10 mm e a. tumefaciens células tendem a crescer melhor perto da bolsa de ar (Figura 1). Nota: Para a imagem latente de células fixas ou em condições onde o crescimento não é monitorizado, uma bolsa de ar não é necessária.</li>
		<li>Ponto 1-0,8 µ l de células sobre a almofada de agarose e cobrir com uma lamela de nova. Coloque delicadamente a lamela por cima da almofada do agarose para distribuir as células em toda a superfície da almofada do agarose.</li>
		<li>Selar as bordas da lamela usando VALAP derretida (consulte a Tabela de materiais para a receita; Figura 1A, imagem de fundo). A vedação ao longo de todas as bordas e cantos da lamela pode causar secagem do pad agarose, que levará para a derivação de células durante a imagem latente. Nota: A selagem da lamela é necessária somente para a imagem latente de lapso de tempo a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> Figura 1: preparação de almofada Agarose. (A) sequência do protocolo de preparação de almofada de agarose de imagem. Imagem 1 é um slide com a junta de filme de laboratório. Na imagem 2, a almofada de agarose e a bolsa de ar são visualizados. Finalmente, a imagem 3 mostra a almofada de agarose completa com as células sob uma lamela e selado com VALAP. (B), um diagrama esquemático de uma almofada de agarose para microscopia de lapso de tempo é fornecido. Características-chave do pad agarose são etiquetadas no esquema. (C), a bolsa de ar promoveu o crescimento da . tumefaciens em almofadas de agarose. São mostradas imagens de sua a. tumefaciens células cultivadas em uma almofada de agarose para 20 horas. Imagens foram tiradas em posições cada vez mais distantes da bolsa de ar. A distância da borda mais próxima da imagem para o bolso de ar é mostrada acima de cada imagem. Barra de escala = 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>
Imagem latente Nota: Contraste de interferência diferencial, contraste de fase e imagem latente de epifluorescência é realizada com um microscópio invertido equipado com focagem automática baseada em hardware, um palco automatizado, filtros padrão, uma fonte de luz LED, imersão de óleo 60 X objectivos (at 1.4) para contraste de fase ou contraste de interferência diferencial (DIC) e uma câmera de-acoplado-dispositivo de carga (EMCCD) de elétrons-multiplicação de 1K. O microscópio deve ser colocado em uma sala de temperatura controlada. Alternativamente, um palco mais quente ou câmara pode ser usada para manter temperaturas consistentes durante a imagem latente.<ol>
<li>Microscopia de epifluorescência Nota: Para a imagem latente de fluorescência das células vivas, é necessário limitar o número de aquisições de imagem e otimizar o tempo de exposição, para minimizar o fotobranqueamento e fototoxicidade. Para a imagem latente de cada corante, é aconselhável encontrar um tempo de exposição ideal que fornece detecção de fluorescência suficientes, mas não conduz à fotobranqueamento ou fototoxicidade. Nas figuras 2-4, tempos de exposição de 200 ms foram usados para todas as imagens de fluorescência. Para as sequências de lapso de tempo mostradas na Figura 3, imagens foram adquiridas a cada 10 min para 3h.<ol>
<li>Coloque óleo de imersão em atingir o objectivo pretendido e o slide invertido no suporte do slide no palco. Use os botões de focalização para colocar as células em foco.</li>
			<li>Adquira imagens em fase (ou DIC) e o filtro de fluorescência desejado. Nota: Os máximas excitação e emissão de comprimentos de onda para as manchas usados na Figura 2, Figura 3e Figura 4 são os seguintes: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), laranja (547/570).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Microscopia de lapso de tempo Nota: Durante a microscopia de lapso de tempo os seguintes recursos são controlados pelo computador: x, y e z filtros de posição, obturadores e fluorescência. Um sistema de foco automático baseado em hardware é ideal para manter o foco durante a imagem latente de lapso de tempo. Alternativamente, pode ser usado um loop de auto-foco baseados em software.<ol>
<li>Coloque óleo de imersão em atingir o objectivo pretendido e o slide invertido no suporte do slide no palco. Use os botões de focalização para colocar as células em foco.</li>
			<li>Opcionalmente: Adquirir múltiplas (x, y) posições. Selecione aleatoriamente 10 campos de células em estreita proximidade com o bolso de ar das almofadas do agarose.</li>
			<li>Set-up a tempo sequência aquisição de imagem em fase ou DIC no intervalo de tempo desejado. Nota: Para a lapso de tempo sequência mostrada na Figura 4, DIC imagens foram adquiridas com a exposição de 30 ms cada 10min para 14 h. Quando utilizando imagens de fluorescência durante a microscopia de lapso de tempo, ajuste o tempo de exposição e intervalo de aquisição para minimizar fotobranqueamento e fototoxicidade.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo contém uma série de procedimentos para a investigação de cepas da . tumefaciens sua, mutante e esgotamento. É interessante notar que todos os procedimentos listados na seção de protocolo podem ser facilmente adaptados para outras cepas bacterianas com modificações adicionais para dar conta de mídia de crescimento, temperaturas e taxas de crescimento.
O uso de corantes de destino específico é uma ferramenta valiosa para fornecer uma caracterização detalhada...

Progressão através do ciclo celular bacteriano requer a coordenação de muitos processos, incluindo a biossíntese de membrana e parede celular, replicação do DNA e segregação e divisão celular. Para compreender a complexidade da biologia da célula bacteriana, é necessário estudar esses eventos essenciais; no entanto, essa é uma tarefa não trivial desde a viabilidade celular fica comprometida quando componentes-chave destas vias são mutagenized. Microscopia de epifluorescência juntamente com corantes de destino específico é uma poderosa abordagem para investigar estes processos essenciais em sua e estirpes de bactérias mutantes.
Corantes de peptidoglicano específicos incluem fluorescente-d-amino ácidos (por exemplo, 7-Hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina e fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) , NADA; diversos-3-amino-d-alanina; TADA). Em bactérias gram-positivas, o uso de concentrações subletais de análogos de antibióticos fluorescentes para sondar sites da biossíntese do peptidoglicano tem sido uma estratégia eficaz para revelar o peptidoglicano inserção padrões1,2, 3,4. Enquanto rotulagem fluorescente vancomicina tem sido usada para obter insights sobre o peptidoglicano padrões de inserção em bactérias Gram-negativas fixa5, a membrana externa geralmente fornece uma barreira de permeabilidade que impede o uso de fluorescentes antibióticos como uma sonda para a biossíntese do peptidoglicano em células vivas. Em contraste, pulsos de fluorescente-d-amino ácidos ou d-amino ácidos com grupos funcionais de biorthogonal covalentemente rotulam regiões de inserção de peptidoglicano recentes em uma ampla gama de vida células bacterianas6,7. Padrões de inserção de peptidoglicano que têm sido observados com d-aminoácidos sintéticos incluem punctate e septal (Escherichia coli e Bacillus subtilis), polar e septal (Agrobacterium tumefaciens e Listeria monocytogenes), único do septo (Staphylococcus aureus) e apical (Streptomyces venezuelae)6,7. Estas observações indicam que as bactérias apresentam diversos padrões de biogênese de parede celular e que o uso de ácidos d-aminoácido sintéticos como sondas para examinar a padronização de crescimento é uma estratégia valiosa em muitas bactérias.
Corantes que rotulam cromossomos bacterianos incluem o fichário de sulco menor específicas do Ácido desoxirribonucleico (DNA) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) e corantes de cianina de alta afinidade (verde e laranja; consulte a lista de materiais). DAPI coloração de células fixas auxilia na enumeração de bactérias a partir de amostras ambientais8, Considerando que a DAPI coloração de células vivas é usada para indicar a viabilidade bacteriana9. Em contraste, cianina corantes tais como laranja e verde são frequentemente descritos como manchas de célula "morto" impermeant de membrana para enumerar as células não-viáveis9. Notavelmente, quando estes reagentes são usados para sondar a morfologia de nucleoide bacteriana durante o crescimento celular, DAPI, laranja e verde foram todos mostrado membrana permeant e capaz de rotulagem de células vivas10. Em células de Escherichia coli vivas, DAPI coloração de DNA aparece difusa devido a autofluorescência de citoplasma e repetidas exposições de células manchadas de DAPI à luz ultravioleta (UV) perturba o nucleoide estrutura10. Coloração de e. coli ou b. subtilis com laranja revela que este corante é membrana permeant e fornece fluorescência de longa duração com ligação ao DNA em células vivas, sem afetar o crescimento da pilha, o replication do DNA ou segregação do cromossomo10 . Estas observações sugerem que cyanine tinturas de DNA podem ser usadas para monitorar a morfologia da nucleoids durante o crescimento celular de muitas bactérias.
Phospholipid-specific stryl corantes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibrometo de piridínio (4-64; consulte a lista de materiais) são compostos catiônicos e associar preferencialmente com carga negativa fosfolípidos como cardiolipina e fosfatidilglicerol11. Padrões distintos são observados quando 4-64 é usado para rotular a membrana de bactérias diferentes. Em Escherichia coli, 4-64 é enriquecido nos polos, em faixas ao longo da parede lateral e nos sites de divisão de tarde pre-divisional células12. Em Bacillus subtilis, 4-64 rotulagem permite a visualização de lipídios espirais13. Em Agrobacterium tumefaciens, 4-64 rotula a membrana externa e é observado em um padrão característico "ferradura" no qual o polo de crescimento é desprovido de rotulagem de14,15. Estas observações indicam que essas bactérias apresentam distribuições de lipídios heterogênea devido à presença de domínios de lipídios que contribuem para a assimetria celular. Mudanças nos padrões de rotulagem 4-64 como a presença de rotulagem difusa, bolhas ou vesículas, invaginações ou encolhimento de membrana pode ser informativo em caracterizando mutantes que impactam a distribuição ou a biossíntese de lipídios.
Além da coloração de células, é necessário determinar a função das proteínas que participam em processos essenciais. A caracterização das proteínas essenciais é tecnicamente desafiador, porque não é possível excluir genes essenciais e estudar as consequências fenotípicas. Assim, surgiram a abordagens alternativas que empobrecem a proteína. Por exemplo, um gene essencial pode ser colocado sob o controle de um promotor inducible, ao invés de seu promotor nativo. Promotores inducible são sensíveis a pequenas moléculas, tais como; 16, isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, de zinco e xilose23, assim, a transcrição do gene alvo cessa e a proteína de interesse é empobrecida quando o indutor é removido. Abordagens alternativas para esgotar as proteínas essenciais de interesse incluem riboswitches sintético24 que utilizam interações pequena molécula-RNA para dificultar a transcrição dos genes-alvo, CRISPR interferência25,26 para bloco de transcrição dos genes-alvo e Proteína inducible degradação27,28 que usa etiquetas de peptídeos de proteínas alvo para degradação pela ClpXP protease. Cepas de depleção fornecem apenas um curto período de tempo para caracterização antes que as células perdem a viabilidade, portanto, imagens microscópicas de células ao longo do tempo durante a depleção de proteína é uma poderosa abordagem para caracterização. Com efeito, microscopia das células bacterianas vivas permitiu aos pesquisadores obter insights sobre os processos biológicos fundamentais, incluindo os mecanismos de manutenção de forma celular, secreção e compartimentalização29.
A. tumefaciens é uma planta bacteriana patógeno30 e natural engenheiro genético31,32. Assim, os mecanismos relacionados a patogenicidade, incluindo3534,33,do interações patógeno-hospedeiro, secreção36e anfitrião transformação30,31, 37 tem sido extensivamente investigada. Para a concepção de estratégias que impedem a. tumefaciens mediada por doença ou reforçar a transformação da planta, os processos essenciais para a sobrevivência da . tumefaciens precisam ser melhor compreendida. O uso de corantes de destino específico e o recente desenvolvimento de uma estratégia de depleção de proteína pela . tumefaciens18 fornece um meio para investigar os processos essenciais.
Aqui, protocolos detalhados para análise microscópica de cepas de depleção de proteína, mutante e sua da . tumefaciens são fornecidos. Os dois primeiros protocolos descrevem como preparar células e rotulá-los com corantes de destino específico. O terceiro Protocolo fornece instruções passo a passo para preparar pastilhas de agarose (Figura 1) e imagem latente as células bacterianas (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Esses protocolos também podem ser adequados para outras bactérias com adaptações adicionais para condições de diferentes mídias, taxas de crescimento, exigências de oxigênio e estruturas celulares.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. J Bacteriol 123:255-264.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58&amp;Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-&lt;em&gt;ctrA &amp;Delta;ctrA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. 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Autoclave.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT Salts</td><td></td><td></td><td>Add 40 g/L (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 3.2 g/L MgSO4&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and 0.024 g/L MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to water. Autoclave.</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Chemical</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optional Media Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Sparkle Glass Cleaner</td><td>Home Depot</td><td>203261385</td><td>Ammonia and alcohol free.</td></tr><tr><td>Ultra Pure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &amp;deg;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td></tr><tr><td>Lanolin Butter</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Target Corp.</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Crafty Candles</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Target-specific dyes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td></tr><tr><td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td><td></td><td></td><td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry bath</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metallic thermal beads</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td><td></td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td></tr></tbody></table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

Principais processos celulares tais como a replicação do DNA e segregação, síntese proteica, biossíntese da parede celular e divisão celular dependem a função das proteínas que são essenciais para a sobrevivência bacteriana. Uma série de corantes de destino específico pode ser usada como sondas para melhor compreender estes processos. Coloração com corantes lipofílicos permite a observação da estrutura da membrana, visualização de lipídios microdomains e detecção de bolhas de membrana. Uso de fluorescentes-d-amino ácidos (FDAAs) para sondar os locais da biossíntese do peptidoglicano pode indicar potenciais defeitos na parede celular biogênese ou padronização do crescimento celular. Finalmente, as manchas de ácidos nucleicos podem indicar possíveis defeitos na segregação de replicação ou cromossomo de DNA. Cianina DNA manchas rótulo células vivas e são adequado para microscopia de lapso de tempo permitindo observações em tempo real de morfologia nucleoide durante o crescimento celular. Protocolos para a rotulagem de célula podem ser aplicados para os mutantes de depleção de proteína para identificar defeitos na estrutura da membrana, parede celular biogênese ou segregação do cromossomo. Além disso, a microscopia de lapso de tempo pode ser usada para monitorar alterações morfológicas como uma proteína essencial é removida e pode fornecer insights adicionais em função da proteína. Por exemplo, o esgotamento das proteínas essenciais a divisão celular resulta em filamentação ou ramificação, Considerando que a depleção das proteínas de crescimento celular pode causar células tornar-se mais curtos ou mais redondo. Aqui, os protocolos para crescimento celular, destino-específico marcação e microscopia de lapso de tempo são fornecidos para o patógeno bacteriano planta Agrobacterium tumefaciens. Juntos, alvos tintas e microscopia de lapso de tempo permitem a caracterização de processos essenciais em a. tumefaciens. Finalmente, os protocolos fornecidos podem ser facilmente modificados para sondar os processos essenciais em outras bactérias.

Destino-específico marcação de sua A. tumefaciens células A fim de ilustrar essa morfologia celular não é afetada pelas etapas de lavagem ou tratamento com 1% de DMSO (que é usada para diluir os corantes fluorescentes), as células foram fotografadas diretamente da cultura (Figura 2A, painel de extrema-esquerdo), depois de lavar as células por centrifugação conforme descrito no ponto 1....

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Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

live-cell-fluorescence-microscopy-to-observe-essential-processes

Research

JoVE Journal

Biology

15.8K visualizações.  University of Missouri. Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Vídeo: Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Imunologia e Infecção

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Pesquisa do câncer

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

Imagem latente da Live-pilha fluorescência de completa ciclo vegetativo celular do lento crescimento Social bactéria Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Bioquímica

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologia

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Visualização cinética de interespécies interespécies unicelulares interespécies

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

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