Name: enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
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Os autores graças a Véronique de Berardinis para discussão proveitosa e Alain Perret, Christine Pellé e Peggy Sirvain para suporte técnico.

1. preparação enzimática
<ol><li>Express e purificar as proteínas como descrito anteriormente,26. Nota: Proteínas recombinantes foram obtidas com as seguintes concentrações finais: αKAO de Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO de c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs de S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), extrato da célula livre com total enzima 12,44 mg/ml; PLP-DC de c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCnegras), 2,62 mg/mL.</li>
</ol>2. preparação de soluções
Nota: Todas as soluções abaixo são preparadas em água deionizada.
<ol><li>Prepare-se 1 M de tampão HEPES, pH 7,5; ajuste com 5 M de NaOH. Nota: Durante o passo de ajuste de pH, use luvas de proteção, roupas de proteção, proteção para os olhos e rosto proteção (P280). Em caso de contato com os olhos (P305, P351, P338), enxague cuidadosamente com água durante vários minutos remover lentes de contato se possível. Continue enxaguando e chame imediatamente um médico (P310) ou centro de veneno. O código de P refere-se à instrução da precaução (de perigo classe e categoria; Veja, por exemplo, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>Preparar 100 mM L-lisina, 100 mM (5S) - hidroxi - L-lisina, ácido alfa-cetoglutárico 150mm, ascorbato de sódio de 100 mM, 10 mM de amónio iron(II) hexaidrato de sulfato de sódio (sal de Mohr), 100 mM piridoxal 5-fosfato (PLP) e 100mm ditiotreitol (DTT).</li>
	<li>Prepare 1 M, 2M e 6M de ácido clorídrico (HCl) de uma solução de HCl 37% (aproximadamente 12 M solução), seguindo as mesmas instruções de segurança, como as descritas no ponto 2.1. Nota: As soluções de ácido alfa-cetoglutárico, ascorbato de sódio e de amônio hexaidrato de sulfato de iron(II) devem ser feitas frescas no dia do uso. A solução de lisina pode ser armazenada por vários meses à temperatura ambiente. A solução PLP pode ser armazenada durante um mês a 4 ° C. A solução de TDT pode ser armazenada durante um mês a-20 ° C.</li>
</ol>3.-balança analítica reações
<ol><li>Desenvolvimento de método para a reação de descarboxilação (5R) - hidroxi - L-lisina<ol>
<li>Adicionar 11 µ l de solução de 1m de HEPES buffer pH 7,5 (concentração final 50 milímetros) para um microtubo de 2 mL. Em seguida, adicione 22 µ l de 100 mM (5S) - hidroxi - L-lisina (concentração final 10 mM), 2,2 µ l de 100mm PLP (concentração final 1 mM) e 2,2 µ l de 100 mM DTT (concentração final 1 mM). Nota: No caso de reação com LDCSrum, a adição de TDT não é necessária.</li>
		<li>Adicionar o PLP-DC purificado (concentração final de 0,1 mg/mL). Complete com H2O para um volume final de 220 µ l.</li>
		<li>Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 3h. Nota: Agitando a mistura de reação com uma tampa aberta ao ar livre garante uma boa oxigenação da mídia reação. Não é portanto necessário a bolha de oxigênio na mídia reação.</li>
		<li>Colete 10 µ l da mistura de reação, para ser analisado de acordo com o procedimento de controlo de reação descrito na etapa 6. As amostras são preferencialmente derivatizadas e analisadas diretamente após a amostragem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desenvolvimento de método para a reação enzimática em cascata, combinando um passo de hidroxilação catalisado por αKAO com descarboxilação catalisada por PLP-DC<ol>
<li>Adicionar 11 µ l de 1 M de tampão com pH 7,5 HEPES (concentração final 50 milímetros) para um microtubo de 2 mL. Em seguida, adicione 22 µ l de 150 mM de ácido alfa-cetoglutárico (concentração final 15mm), 5,5 µ l de 100 mM de ascorbato de sódio (concentração final 2,5 mM), 22 µ l de 10mm de Mohr de sal (concentração final 1 mM) e 22 µ l de 100 mM de L-lisina (concentração final 10 mM).</li>
		<li>Complete com H2O para um volume final de 220 µ l, tendo em conta o volume da solução de enzima a ser adicionado na etapa 3.2.3.</li>
		<li>Adicionar a enzima αKAO purificada necessária de acordo com a alvo regioseletividade: KDO1 para hidroxilação em posição C-3 ou KDO2 para a posição C-4 de L-lisina. A concentração final da enzima purificada (0,05-0,5 mg/mL) foi determinada permitir uma conversão completa em cerca de 3 h.</li>
		<li>Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 3h.</li>
		<li>Adicionar 2,2 µ l de 100 mM do PLP (concentração final ~ 1 mM) e 2,2 µ l de 100 mM da televisão digital terrestre (concentração final ~ 1 mM). Nota: No caso de reação com LDCSrum, a adição de TDT não é necessária.</li>
		<li>Adicionar o PLP-DC purificado numa concentração permitindo a conversão completa em 18 h: LDCSrum uma concentração final aproximada de 0,1 mg/mL para a reação em cascata com KDO1 e DCnegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL para o reação em cascata com KDO2.</li>
		<li>Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre com 300 rpm para 18 h.</li>
		<li>Execute um procedimento de controlo como no passo 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desenvolvimento de método para a reação enzimática em cascata, combinando duas etapas de hidroxilação catalisadas por αKAOs com descarboxilação catalisada por PLP-DC<ol>
<li>Execute etapas 3.2.1-3.2.2.</li>
		<li>Adicione KDO1 em uma concentração final de 0,05 mg/mL. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 3h.</li>
		<li>Adicione KDO2 a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 18 h.</li>
		<li>Execute o passo 3.2.5.</li>
		<li>Adicione o PLP-DC DC purificadanegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 18 h.</li>
		<li>Execute o procedimento de controlo como no passo 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. semipreparativa um pot-Biocatalytic reação
Nota: Reações enzimáticas são realizadas em 0,1 mmol de L-lisina em um frasco de Erlenmeyer para um volume total de 10 mL de vidro 250ml ao ar livre.
<ol><li>Síntese de derivados da monohydroxylated<ol>
<li>Adicionar 0,5 mL de tampão HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentração final 50 mM) ao balão. Em seguida, adicione 1 mL de 100 mM L-lisina (concentração final 10 mM), 1 mL de ácido alfa-cetoglutárico 150mm (concentração final 15mm), 0,25 mL de ascorbato de sódio de 100 mM (concentração final 2,5 mM), e 1 mL de 10mm Mohr de sal (concentração final 1 mM).</li>
		<li>Complete com H2O para um volume final de 10 mL, tendo em conta o volume da solução de enzima a ser adicionado na etapa 4.1.3.</li>
		<li>Adicionar a enzima αKAO purificada necessária de acordo com a alvo regioseletividade: KDO1 em uma concentração final de 0,075 mg/mL para a hidroxilação na posição C-3 ou KDO2 em uma concentração final de 0,5 mg/mL para a posição C-4 de L-lisina. Determinou-se a concentração final da enzima purificada para permitir uma conversão completa em cerca de 3 h.</li>
		<li>Agite a mistura de reação na temperatura de quarto a 300 rpm para a duração apropriada. Quando o monitoramento da reação indica uma reação de hidroxilação concluído (executar todas as etapas detalhadas no passo 6 para a reação de protocolo de monitorização), vá para a etapa 4.1.5. Um tempo de reação típico é de 3h.</li>
		<li>Adicionar 100 µ l de 100mm PLP a mistura de reacção αKAO (concentração final ~ 1 mM). Em seguida, adicionar 100 µ l de 100 mM DTT (concentração final ~ 1 mM), exceto quando usando o LDCSrum.</li>
		<li>Adicionar purificada PLP-DC: LDCSrum uma concentração final aproximado de 0,05 mg/mL para a reação em cascata com KDO1 ou DCnegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL para a reação em cascata com KDO2.</li>
		<li>Agitar a mistura de reação à temperatura ambiente, 300 rpm, para 18 h e continuar diretamente para as etapas detalhadas no passo 4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Síntese do derivado dihydroxylated<ol>
<li>Adicionar 0,5 mL de tampão HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentração final 50 mM), 1 mL de 100 mM L-lisina (concentração final 10 mM), 1 mL de ácido alfa-cetoglutárico 150mm (concentração final 15mm), 0,25 mL de ascorbato de sódio de 100 mM (concentração final 2,5 mM) , e 1 mL de 10mm Mohr de sal (concentração final 1 mM). Complete com H2O para um volume final de 10 mL, tendo em conta o volume da solução de enzima a ser adicionado na etapa 4.2.2.</li>
		<li>Adicione KDO1 para uma concentração final de 0,075 mg/mL. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, a 300 rpm para a duração apropriada.</li>
		<li>Quando o monitoramento da reação indica uma reação de hidroxilação concluído (consulte a etapa 6 para a reação de protocolo de monitorização), prossiga para a etapa 4.2.5. Um tempo de reação típico é de 3h.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de ácido alfa-cetoglutárico 150mm (concentração final 15mm), 0,25 mL de ascorbato de sódio de 100 mM (concentração final 2,5 mM), e 1 mL de 10mm Mohr de sal (concentração final 1 mM).</li>
		<li>Adicione KDO2 para uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial. Agite a mistura de reação na temperatura de quarto a 300 rpm para 18 h.</li>
		<li>Quando o monitoramento da reação indica uma reação dihydroxylation concluído (consulte a etapa 6 para a reação de protocolo de monitorização), prossiga para a etapa 4.2.7. Um tempo de reação típico é 18 h.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de 100 mM da televisão digital terrestre (concentração final ~ 1 mM), exceto quando usando o LDCSrum.</li>
		<li>Adicione o DC purificadanegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial.</li>
		<li>Agite a mistura de reação na temperatura de quarto a 300 rpm para 18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Têmpera<ol>
<li>Arrefecer a mistura de reação, colocando o copo de 250 mL frasco Erlenmeyer num banho de gelo.</li>
		<li>Adicione cuidadosamente, ao longo de aproximadamente 1 min, 0,25 mL de 6 M HCl, agitando manualmente delicadamente a mistura de reação de refrigeração. Siga as mesmas instruções de segurança, como os descritos no passo 2.1.</li>
		<li>Transferência a mistura ácida em uma centrífuga de fundo cónico de 50 mL do tubo usando um pipeta Pasteur equipada de vidro com um bulbo, então centrifugar a 1.680 x g e 4 ° C por 15 min.</li>
		<li>Retirar o sobrenadante e reserve em um balão de fundo redondo de 250 mL.</li>
		<li>Adicione 10 mL de água desionizada para o tubo de centrifuga fundo cónico contendo a pelota. Vórtice para Ressuspender o sedimento.</li>
		<li>Centrífuga a 1.680 x g, 4 ° C, por 15 min.</li>
		<li>Retirar o sobrenadante e adicioná-lo para o balão de fundo redondo de 250 mL contendo o primeiro sobrenadante (passo 4.3.4).</li>
		<li>Congelar os sobrenadantes coletados pela imersão do balão no nitrogênio líquido com mão constante agitação e transferir o frasco imediatamente para um colector de bancada Liofilizador para impedir que o material de descongelamento.</li>
		<li>Após o processo de liofilização é completo (overnight), retire o balão o liofilizador.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. purificação de Amino álcoois bruto reacção enzimática
<ol><li>Resina de troca iônica<ol>
<li>Dissolver o produto liofilizado no montante mínimo de aquosa 0,1 M de HCl (cerca de 4 mL) até partículas sólidas já não são visíveis o olho nu.</li>
		<li>Condição de uma resina de troca de cátion do grupo funcional ácido sulfônico, malha de 200-400, em uma coluna de vidro (20 x 250 mm) por eluição à pressão atmosférica de 1 M HCl (volumes de coluna 4) seguido de 0.1 M HCl (4 volumes de coluna; volume de coluna = 10 mL).</li>
		<li>Carrega a amostra cuidadosamente na parte superior da resina nas paredes da coluna de vidro usando uma micropipeta de 1.000 µ l. Em seguida, enxaguar o tubo cónico-parte inferior que continha o produto bruto três vezes com 1 mL 0,1 M de HCl solução aquosa por lavar e carregar os volumes de enxaguamento resultante para a coluna da mesma forma.</li>
		<li>Eluir com um não-linear gradiente: 4 volumes de coluna de 0.1 M HCl, 4 volumes de coluna de água, 4 volumes de coluna de 5% NH4OH, 4 volumes de coluna de 10% NH4OH, 4 volumes de coluna de 15% NH4OH, 4 volumes de coluna de 20% NH4OH , 4 volumes de coluna de 25% de NH4OH e por último 4 volumes de coluna de 28% NH4OH.</li>
		<li>Monitorar a purificação por HPLC (consulte a etapa 6).</li>
		<li>As frações contendo o composto (NH4OH 20-28%) do pool e congela, conforme descrito em etapas 4.3.8-4.3.9. Nota: A coluna de troca iônica pode ser reutilizada após eluição com água desionizada para neutralização de água de eluição (aproximadamente 50 mL) seguida de recondicionamento por eluição com 50 mL de 1 M de HCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>Solubilize o composto liofilizado em cerca de 2 mL de H3PO4/water (20 µ l/mL).</li>
		<li>Lugar um modo misto permutadora de catiões SPE 6 mL-cartucho sobre um colector de extração ligado a uma bomba de água. Condição do cartucho pelo desenho através de 4 mL de metanol sob pressão reduzida fornecida pelo colector de. Equilibrar o cartucho pelo desenho através de 4 mL de H3PO4/water (20 µ l/mL).</li>
		<li>Carregar a amostra para o cartucho usando uma micropipeta µ l 1.000 no topo da resina nas paredes da coluna de vidro e enxaguar o frasco que contém o produto três vezes com 0,75 mL de H3PO4/water (20 µ l/mL), por lavagem. Carrega o volume resultante de enxaguamento para a coluna da mesma forma.</li>
		<li>Lavar o cartucho por eluição sob pressão reduzida, fornecida pelo colector de, 4 mL de 2% HCOOH na água e, em seguida, com 4 mL de água. Eluir com um gradiente de NH4OH em água (4 mL para cada eluição, a partir de 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% e 28%).</li>
		<li>Monitore a purificação por HPLC, analisando cada fração de acordo com a reação de monitoramento protocolo descrito na etapa 6. Mantenha todas as frações que contêm puro derivado desejado de acordo com o cromatograma de (UV) ultravioleta e prossiga para a etapa 5.2.6.</li>
		<li>Piscina as frações contendo o desejado composto para uma 100 mL redonda balão de fundo, lave os tubos contendo as frações com água e adicionem o volume de lavagem para os 100 mL redonda balão de fundo.</li>
		<li>Remova o solvente sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo equipado com um termostato banho jarro eléctrico a 40 ° C e ligado a uma bomba de vácuo de 10 mbar.</li>
		<li>Solubilizar o sólido em um volume mínimo de água e transferir a solução para uma pesada 25 mL redonda balão de fundo. Lavar o balão com um volume mínimo de água, adicionar o volume de lavagem para o balão de 25 mL e prossiga para a etapa 5.2.9.</li>
		<li>Pesar o produto purificado e calcular o rendimento.</li>
		<li>Dissolver o produto purificado no volume mínimo de 2M de HCl até partículas sólidas não são mais visíveis para o olho nu e congela, conforme descrito em etapas 4.3.8-4.3.9. Nota: Os aminoácidos álcoois são compostos sensíveis e são mantidos como seus sais de cloridrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. reação de monitoramento e análises de produtos
<ol><li>Derivatização de substratos e produtos antes da análise por HPLC Nota: Os substratos e produtos precisam ser derivatizado como derivados aromáticos para aumentar sua detectivity cromatográfica de UV. Nós usamos 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB). Cada amostra foi injetada a HPLC imediatamente após derivatização.<ol>
<li>Leve 10 µ l da reação enzimática e transferência para um microtubo de 1,5 mL. Adicione 10 µ l de 0,25 M de solução aquosa de NaHCO3 , 100 µ l de etanol e 30 µ l de 2,5 mg/mL de solução DNFB em etanol.</li>
		<li>Feche o microtubo e agite a solução resultante por 1h a 65 ° C, a 1.000 rpm. Saciar com 10 µ l 1 M de HCl.</li>
		<li>Filtrar com um filtro de seringa não estéreis de diâmetro de 4 mm com uma 0,22 µm poro tamanho hidrofílico polivinilideno fluoreto (PVDF) membrana usando uma seringa de 1 mL Luer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize monitoramento da reação da dioxigenase usando qualquer sistema capaz de separar pyrazole de aminoácidos. Este protocolo envolve detecção no ultravioleta de aminoácidos derivatizado pelo grupo cromóforo dinitrobenzeno (DNB)27.<ol>
<li>Encaixe a HPLC com C18 com uma trimetil silil endcapping fase reversa coluna (5 µm, 3 x 150 mm).</li>
		<li>Equilibrar a coluna C18 com o eluente (30:70) B (MeCN + 0,1% TFA) de eluente A (H2O + 0,1% TFA) a uma taxa de fluxo de 1 mL/min e 35 ° C por 15 min (correspondente a cerca de 20 volumes de coluna).</li>
		<li>Injectar 10 µ l da mistura de reação pyrazole (consulte a etapa 6.1) na coluna C18 de HPLC. Usar uma mistura de MeCN, 0,1% TFA/H2O e 0,1% TFA como eluente com um gradiente linear (ratio 30:70 para 70:30 em 9 min, temperatura de 35 ° C, fluxo de 1ml/min).</li>
		<li>Usar a detecção de UV de 400 nm para analisar os produtos eluídos na coluna cromatográfica. DNB-lisina elutes normalmente cerca 6,5 min, hidroxilado DNB-lisina em torno de 5,5 min, dihydroxylated DNB-lisina em torno de 4,2 min e DNB-aminodiol em torno de 5,3 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. NMR análise de purificado Amino álcoois
<ol><li>Dissolver purificadas aminoácidos álcoois em D2O (700 µ l) e transferir a solução para um tubo de ressonância magnética Nuclear (RMN).</li>
	<li>Aquisição de 1H e espectro de RMN de C 13de acordo com o apropriado NMR facilidade protocolos28.</li>
</ol>

<ol>
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Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Approaches+towards+the+Synthesis+of+Chiral+Amino+Alcohols+from+Lysine:+Cascade+Reactions+Combining+alpha-Keto+Acid+Oxygenase+Hydroxylation+with+Pyridoxal+Phosphate-+Dependent+Decarboxylation.">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. 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Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. 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J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Derivados e álcoois quirais de aminoácidos têm uma ampla gama de aplicações, desde auxiliares quirais para a síntese orgânica para terapia farmacêutica. Síntese de várias etapas para a produção de aminoácidos álcoois por síntese orgânica convencional são numerosos, mas nem sempre é eficiente porque passos de proteção/desproteção tedioso juntamente com um controle sensível do estereoquímica16. Uma abordagem biocatalytic que dispensa as medidas de proteção/desproteção e ?...

Apesar dos benefícios oferecidos por biocatálise, a integração das etapas biocatalytic em vias sintéticas ou rotas biocatalytic totais permanece na sua maioria limitada a resoluções de cinéticas enzimáticas. Estas rotas têm sido amplamente utilizadas como um primeiro passo na síntese assimétrica de quimio-enzimático, mas biocatálise oferece muitas possibilidades mais no grupo funcional interconversões com elevada estereosseletividade1,2,3 . Além disso, como reações de biocatalytic são realizadas em condições similares, portanto, é viável para realizar reações em cascata em uma moda de um pot-4,5.
Quirais aminoácidos álcoois são moléculas versátil para uso como auxiliares ou andaimes em síntese orgânica6. O grupo amino álcool é frequentemente encontrado em metabólitos secundários e em ingredientes farmacêuticos ativos (API). Álcoois primários β-amino estão prontamente disponíveis a partir dos correspondentes ácidos α-amino por síntese química convencional, mas o acesso para álcoois quirais de γ-amino ou álcoois secundários aminoácidos requer muitas vezes tediosas vias sintéticas junto com sensível controle da estereoquímica7,8,9,10. Devido à sua elevada estereosseletividade, biocatálise pode fornecer uma rota sintética superior a esses blocos de construção quirais11,12,13,14.
Nós relatamos anteriormente a síntese de mono - e di-hidroxi-L-lisinas por diastereoselective hidroxilação enzimática catalisada por dioxygenases do ferro (II) / α-ketoacid-dependente família oxigenase (αKAO) (Figura 1)15. Em particular, a partir de L-lisina, a dioxigenase KDO1 catalisa a formação doS(3) - hidroxi derivado (1), enquanto o (R. 4) - derivado (2) é formado pela reação com dioxigenase KDO2. Sucessivas regiodivergent hydroxylations por KDO1 e KDO2 levam à formação doR, 4R(3) - dihidroxi - L-lisina (3) na forma opticamente pura. No entanto, a gama limitada de substrato destas enzimas impede sua grande utilização na síntese química, especialmente na hidroxilação de aminas simples, como um moiety ácido carboxílico em posição α do grupo amino é essencial para a atividade16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> Figura 1: Biocatalytic conversões de L-lisina. Conversão em (3S) - hidroxi - L-lisina (1) catalisada por KDO1 dioxigenase; (4R) - hidroxi - L-lisina (2) catalisada por KDO2 dioxigenase; e 3R, 4R- dihidroxi - L-lisina (3) pela reação em cascata sucessivamente catalisada por dioxygenases KDO1 e KDO2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Descarboxilação é uma reação comum no metabolismo17. Em particular, aminoácido DCs (CE 4.1.1) está livre de cofator (pyruvoyl-dependente) ou enzimas PLP-dependentes e catalisar a descarboxilação de aminoácidos para as correspondentes poliaminas em bactérias e maior organismos18,19 , 20 , 21 , 22. o mono - e compostos (Figura 3) 4–7, 10–11 correspondem a cadaverina hidroxilada, a diamina obtida pela descarboxilação da L-lisina. Cadaverina é um bloco de construção fundamental para a indústria química, especificamente é um componente de polímeros de poliamida e poliuretano. Portanto, produção de base biológica desta diamina partir de recursos renováveis tem atraído a atenção como uma alternativa à rota do petróleo-baseados, e vários microorganismos têm foi projetados para essa finalidade. Estas vias metabólicas, lisina DC (PMD) é a enzima chave. LDC é uma enzima PLP-dependentes pertencentes ao alanina racemase (AR) estruturais família23. Os DCs PLP-dependentes (PLP-DCs) são conhecidas por serem altamente específicas do substrato. No entanto, algumas enzimas possuem a capacidade de promiscuidade ligeira, sendo ativo no sentido de aminoácidos L-ornitina e L-lisina, como por exemplo o LDC de Selenomonas rumirantium (LDCSrum), que tem similares constantes cinéticas para lisina e ornitina descarboxilação24,25. Este substrato estendido especificidade desta enzima faz com que um bom candidato para a descarboxilação de mono - e di-hidroxi-L-lisina. Além disso, para localizar DCs ativo para os derivados de hidroxila de lisina, examinamos o contexto genômico dos genes que codificam as enzimas αKAO. Com efeito, em genomas procariontes os genes que codificam enzimas envolvidas na via biossintética mesma são geralmente co localizados em clusters de gene. O gene KDO2 (de Chitinophaga pinensis) foi encontrado co localizados com um gene que codifica o putativo PLP-DC (Figura 2). Em contraste, nenhuma codificação de gene para DC foi encontrado quando se analisa o contexto genômico da dioxigenase KDO1. A proteína do PLP-DC de c. pinensis (DCnegras), portanto, foi selecionada como um candidato promissor para catalisar o passo de descarboxilação da reação em cascata.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> Figura 2: contexto genômico do gene KDO2 em c. pinensis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Consequentemente, nós projetamos as reações enzimáticas da cascata envolvendo dioxygenases e DCs para atingir a síntese de álcoois alifáticos quiral β e γ-amino de aminoácidos (Figura 3). Como relatado anteriormente, a oxidação de C-H catalisada pela αKAO apresenta o centro estereogênico hidroxi-substituídos com diastereoseletividade total; a quiralidade Cβ/γ será preservada na etapa de dimerização, que afeta somente o carbono Cα do ácido aminado moiety16.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> Figura 3: análise Retrosynthetic. (A) Retrosynthesis de β e γ-amino álcoois (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hidroxi - L-lisina e (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5) e 1,5-diaminopentan-3-ol (6) de L-lisina. (B) Retrosynthesis de β, γ e β, δ-amino dióis (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (10) e 2R, 4S- 1,5 - diaminopentane-2,4-diol (11) a partir de (R. 5)- hidroxi-L-lisina e 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7) a partir de L-lisina. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A partir de L-lisina e seus (5R)-hidroxi derivado, nós relatamos aqui um dois/três passo, um pote, procedimento enzimático combinando dioxygenases e PLP-DCs para obter o destino aminoácidos álcoois. Antes da síntese em escala de laboratório das moléculas do alvo, o método foi desenvolvido em escala analítica para ajustar as condições de reação, por exemplo, as concentrações de enzima, necessárias para permitir que a conversão completa das matérias-primas; apresentamos este procedimento também.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-hydroxy-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GPS NONH</td><td>Out sourcing</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-ketoglutaric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Acros</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLC System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA detector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm syringe filters - 0,22&amp;micro;m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Cation exchange resin 100-200&amp;nbsp;mesh</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td><td>Waters</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>Extraction manifold</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 500 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL microtube</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL round-bottom flask 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL erlenmeyer flask</td><td>Fischerbrand</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

Aminoácidos álcoois são compostos versáteis com uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, eles têm sido usados como quirais andaimes em síntese orgânica. Sua síntese por convencional de química orgânica, muitas vezes, requer processos de síntese de várias etapas tedioso, com difícil controle do resultado estereoquímica. Apresentamos um protocolo para enzimaticamente sintetizar amino álcoois a partir de L-lisina prontamente disponível em 48h. Este protocolo combina duas reações químicas que são muito difíceis de realizar por síntese orgânica convencional. Na primeiro passo, a regio - diastereoselective oxidação e de uma ligação C-H não ativada de lisina da cadeia lateral é catalisada por uma dioxigenase; uma segunda oxidação regio - e diastereoselective, catalisada por uma dioxigenase regiodivergent pode levar à formação da 1,2-dióis. Na última etapa, o grupo carboxílico do aminoácido alfa é clivado por uma descarboxilase piridoxal-fosfato (PLP) (DC). Esta etapa de dimerização afeta somente o carbono alfa de aminoácidos, mantendo o centro estereogênico hidroxi-substituídos na posição beta/gama. Aminoácidos álcoois resultantes são, portanto, opticamente enriquecidos. O protocolo foi aplicado com sucesso para a síntese de semipreparative-escala de quatro aminoácidos álcoois. Monitoramento das reações foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) após derivatização pelo 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno. Simples purificação pela extração de fase sólida (SPE) oferecidas os aminoácidos álcoois com excelente rendimento (93% de > 95%).

Temos relatado anteriormente a síntese de mono - e di-hidroxi-L-lisinas por diastereoselective hidroxilação enzimática catalisada por dioxygenases do ferro (II) / αKAO família (Figura 1)16. Para otimizar o protocolo das cascatas toda apresentada aqui, que combinam um ou dois passos de hidroxilação catalisados por uma αKAO, seguido por uma etapa de descarboxilação catalisada por um Pip-DC, as condições de reação foram aju...

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Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Quirais aminoácidos álcoois são moléculas versátil para uso como andaimes em síntese orgânica. A partir de L-lisina, sintetizar aminoácidos álcoois por uma reação em cascata enzimática combinando diastereoselective C-H oxidação catalisada por dioxigenase seguido por clivagem do moiety ácido carboxílico do aminoácido correspondente hidroxila por um descarboxilase.

Reações Enzimáticas em Cascata para a Síntese de Aminoálcoois Quirais a partir de L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

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12.0K visualizações.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. Quirais aminoácidos álcoois são moléculas versátil para uso como andaimes em síntese orgânica. A partir de L-lisina, sintetizar aminoácidos álcoois por uma reação em cascata enzimática combinando diastereoselective C-H oxidação catalisada por dioxigenase seguido por clivagem do moiety ácido carboxílico do aminoácido correspondente hidroxila por um descarboxilase.

Vídeo: Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

preparação e<em&gt; In Vivo</em&gt; O uso de uma sonda baseado em atividades para<em&gt; N</em&gt; Amidase Ácido -acylethanolamine

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Bioquímica

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

A hidrólise de um Ni-base de Schiff complexa usando condies adequadas para a retenção dos grupos protectores ácido-lábil

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Highly Stereoselective Synthesis of 1,6-Ketoesters Mediated by Ionic Liquids: A Three-component Reaction Enabling Rapid Access to a New Class of Low Molecular Weight Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form catalytically active N-Heterocyclic Carbenes (NHCs). Here we have used ILs as precatalysts in the addition of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes to chalcones to form 1,6-ketoesters, incorporating an anti-diphenyl moiety in a highly stereoselective fashion. The reaction has a broad substrate scope and several functional groups and heteroaromatics can be integrated into the ketoester backbone in generally good yields with maintained stereoselectivity. The reaction protocol is robust and scalable. The starting materials are inexpensive and the products can be obtained after simple filtration, avoiding solvent-demanding chromatography. Furthermore, the IL can be recycled up to 5 times without any loss of reactivity. Moreover, the 1,6-ketoester end product is a potent gelator in several hydrocarbon based solvents. The method enables rapid access to and evaluation of a new class of low molecular weight gelators (LMWGs) from recyclable and inexpensive starting materials.

Ionic liquids (ILs) mediate fast, simple and cheap access to 1,6-ketoesters in high diastereoselectivities and good yields. The reaction protocol is robust and the 1,6-ketoesters can be obtained in gram scale after a simple filtration protocol. Moreover, the 1,6-ketoesters are potent gelators in hydrocarbon solvents.

Síntese altamente Stereoselective de 1,6-cetoésteres Mediada por líquidos iônicos: A reacção de três componente permitindo o rápido acesso a uma nova classe de baixo peso molecular Gelators Peso

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form ...

Química

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Efficient Construction of Drug-like Bispirocyclic Scaffolds Via Organocatalytic Cycloadditions of &#945;-Imino &#947;-Lactones and Alkylidene Pyrazolones

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. Recently, we have developed an efficient organocatalytic strategy, which provides facile access to a variety of enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons. In this paper, we demonstrate a detailed protocol for the asymmetric synthesis of drug-like bispirocyclic compounds with two spirocyclic carbon centers via an organocatyltic 1,3-dipolar cycloaddition reaction. Spirocyclization synthons &#945;-imino &#947;-lactones and alkylidene pyrazolones are prepared first, which are then subjected to a cycloaddition reaction in the presence of a bifunctional squaramide organocatalyst to afford the desired bispirocycles in high yields and excellent stereoselectivities. Chiral high-performance liquid chromatography (HPLC) is carried out to determine the enantiomeric purity of the products, and the d.r. value is examined by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). The absolute configuration of the product is assigned according to an X-ray crystallographic analysis. This synthetic strategy allows scientists to prepare a diversity of bispirocyclic scaffolds in high yields and excellent diastereo- and enantioselectivities.

Enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons are asymmetrically synthesized through a simple organocatalytic 1,3-dipolar cycloaddition reaction.

Construção eficiente de andaimes de drogas, como Bispirocyclic Via Organocatalytic cicloadições de γ-lactonas α-Imino e pirazolonas Alkylidene

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. ...

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very difficult and laborious to make aziridines in optically pure forms on a large scale to apply asymmetric synthesis of aza compounds. Fortunately, we successfully achieved both enantiomers (2R)- and (2S)-aziridine-2-carboxylates with the electron-donating &#945;-methylbenzyl group at the ring nitrogen as non-activated aziridines. These starting aziridines have two distinct functional groups-highly reactive three-membered ring and versatile carboxylate. They are applicable in ring-opening or ring-transformation with aziridine and in functional group transformation to others from carboxylate. Both of these enantiomers were utilized in the preparation of biologically important amino acyclic and/or aza-heterocyclic compounds in an asymmetric manner. Specifically, this report describes the first expedient asymmetric synthesis of both enantiomers of 5, 6-dihydrouracil-type marine natural products biemamide B and D as potential TGF-&#946; inhibitors. This synthesis consisted of regio- and the stereoselective ring-opening reaction of aziridine-2-carboxylate and subsequent formation of 4-aminoteterahydropyrimidine-2,4-dione. One more example in this protocol dealt a highly stereoselective Mukaiyama reaction of aziridine-2-carboxylate and silyl enol ether, following intramolecular aziridine ring-opening to provide easy and facile access to (-)-epiallo-isomuscarine.

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

In this study, we prepare both enantiomers of aziridine-2-carboxylate, which are used in the asymmetric synthesis of alkaloids, including biemamide B and D, and (-)-epiallo-isomuscarine.

Preparação de Aziridinas Não Ativadas Enantiopure e Síntese de Biemamida B, D e epiallo-Isomuscarina

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very ...

Organocatalysis

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of organocatalysis by illustrating the proper setup of a reaction that utilizes enamine catalysis. Organocatalysis is a form of catalysis that uses substoichiometric amounts of small organic molecules to accelerate reactions. This type of catalysis is complementary to other forms of catalysis such as transition metal or biocatalysis. Transition metal catalysis involves transition metals as catalysts and biocatalysis uses enzymes as catalysts. Some advantages of organocatalysis include the low toxicity and cost of the organocatalysts in comparison to many metal catalysts. In addition, most organocatalysts are not sensitive to air and moisture, unlike metal catalysts. In contrast to enzymes found in living organisms, the small molecules that act as organocatalysts are typically easy to access. Furthermore, organocatalysis offers complementary and new reactivity not observed with other forms of catalysis.

Organocatalysis: Principles and Applications

Organocatálise

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of ...

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Química Orgânica II

Acid Halides to Esters: Alcoholysis

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce esters. The mechanism proceeds in three steps:
<ol>
	<li>First, the alcohol acts as a nucleophile and attacks the acyl carbon to form a tetrahedral intermediate.</li>
	<li>Next, the carbonyl re-forms with the loss of a chloride ion.</li>
	<li>Lastly, the positively charged intermediate loses a proton to give an ester as the final product along with H3O+, making HCl an overall byproduct of the reaction.</li>
</ol>
<img alt="Nucleophilic acyl substitution mechanism; chemical reaction sequence diagram; organic chemistry." src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 200px;" data-altupdatedat="1747830616000" data-alt="Nucleophilic substitution reaction, mechanism diagram, organic chemistry, molecular transformation.">
Pyridine is used as a base to neutralize the acidic reaction mixture.
Alcoholysis of sulfonyl chlorides follows a similar pattern and forms sulfonic acid esters.
<img alt="Chemical reaction; synthesis of ester, diagram shows reagent interaction, product formation steps." src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 75px;" data-altupdatedat="1747830616000" data-alt="Chemical reaction diagram; synthesis of ethyl p-toluenesulfonate from tosyl chloride and ethanol.">

Haletos de Ácido a Ésteres: Alcoólise

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce ...

Reações Enzimáticas em Cascata para a Síntese de Aminoálcoois Quirais a partir de L-lisina

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