Name: quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão (KAKENHI) para KH (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), KY (#26461532) e um subsídio para o estudo do projeto de doença intratável do Ministério da Saúde, trabalho e Previdência (K.Y. #201510032A). Agradecemos ao grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste manuscrito.

Consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Use luvas para minimizar a contaminação da amostra por SM derivado de pele. O presente protocolo foi aplicado às células HeLa cultivadas na mínimo essencial suplementado do águia com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 1.000 U/L penicilina e estreptomicina 100 mg/L.
1. preparação das amostras de lipídios
Nota: É importante que todos os produtos vidreiros, incluindo tubos de ensaio com tampas de rosca Teflon revestido isento de detergente.
<ol><li>Extração da fração lipídica total de homogeneizado de célula usando o método de Bligh & Dyer7<ol>
<li>Remover a cultura (ou condicionado) meios de cultura de tecido de 10cm prato e lavar duas vezes com 6 mL de PBS gelado.</li>
		<li>Adicione 1 mL de PBS gelado para o prato de cultura de tecido de 10 cm, com uma pipeta P1000. Colher as células com raspadores de célula e coletar em tubos de plástico siliconizados 2,0 mL.</li>
		<li>Após centrifugação (1.000 × g, 5 min, 4 ° C), remova o sobrenadante por uma pipeta P1000.</li>
		<li>Adicione 1 mL de metanol. Vórtice tubos brevemente e proceda à sonicação em 200 W por 5 min em um sonicador de banho-tipo. Nota: Ajuste o nível de água em um sonicador de banho-tipo para que o centrifugado eficientemente é homogeneizado.</li>
		<li>Pipeta, transferi o homogenate de célula em metanol em tubos de ensaio (13 x 100 mm), com tampas de rosca Teflon-alinhado.</li>
		<li>Adicione 1 mL de metanol, 1 mL de clorofórmio, 0,8 mL de água bidestilada e 50 µ l de 10 µmol/L de d18:1 padrão interno /(D31)-16:0 SM para cada tubo de ensaio.</li>
		<li>Tubos de ensaio de vórtice vigorosamente por 5 min à temperatura ambiente. Nota: A esta altura, uma única fase (clorofórmio/metanol/água = 1/2/0,8 (v/v/v)) é formado.</li>
		<li>Adicione 1 mL de clorofórmio e 1,0 mL de água bidestilada.</li>
		<li>Tubos de vórtice vigorosamente a 2.500 rpm durante 5 min à temperatura ambiente. Nota: neste ponto, o aquosa fase (superior) e a fase orgânica (inferior) é separada.</li>
		<li>Após centrifugação (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), coletar e transferir a fase inferior em tubos de vidro descartável (fase inicial inferior). Nota: Recolha a fase inferior usando uma pipeta Pasteur e um filtro de pipeta de segurança. Insira a ponta da pipeta na fase inferior, aperte o bulbo pequeno ao lado da válvula de 'E' entregar-se a fase superior e cotão interfacial dentro a ponta da pipeta e em seguida a fase inferior do sifão dentro da pipeta.</li>
		<li>Adicione 2 mL de clorofórmio em tubos de ensaio e vórtice os tubos vigorosamente a 2.500 rpm durante 5 min à temperatura ambiente suficientemente misturar com a fase superior e cotão interfacial.</li>
		<li>Após centrifugação (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), coletar e transferir a fase inferior modificada para os tubos de vidro descartável com a fase inicial inferior como descrito na etapa 1.1.10.</li>
		<li>Coloque os tubos de vidro sob um fluxo de nitrogênio e remover completamente os solventes orgânicos na fase inferior coletada.</li>
		<li>Reconstituir as amostras com 500 µ l de metanol ou etanol, filtrar com um filtro de 0,02 µm e armazenar em frascos de vidro a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra para construir a curva de calibração e validação do método<ol>
<li>Adicionar 50 µ l de 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ou 50 µmol/L de padrão composto (d18:1 /(D9)-18:1 SM) em tubos de ensaio com tampas de rosca Teflon-alinhado.</li>
		<li>Adicionar homogenate de célula para cada tubo de ensaio e adicionar 1 mL metanol. Nota: A quantidade de célula homogeneizado como uma matriz varia de acordo com cada experiência. Se a espécie de SM em amostras derivadas de células numa placa de cultura de 10 cm é rotineiramente analisada, a quantidade de células homogeneizado em cada tubo de ensaio deve ser próximo ao de células numa placa de cultura de 10 cm.</li>
		<li>Extrato da fração lipídica total conforme descrito em etapas 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Prepare a verificação da qualidade (QC) amostras para validar o método como descried em etapas 1.2.1-1.2.3. Preparar três QC amostras com concentrações diferentes de padrão composto (d18:1 /(D9)-18:1 SM): um dentro de 3 x o limite inferior da curva padrão (QC-baixo, QC-L), um perto do centro (QC-médio, QC-M) e um perto do limite superior da curva padrão (QC-alta, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM análise por LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Preparação da fase móvel<ol>
<li>Mistura de solventes (acetonitrilo/metanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) para a fase aquosa e isopropanol para a fase orgânica) em garrafas com tampas de rosca Teflon revestido de vidro e proceda à sonicação por 5 min em um sonicador de banho-tipo.</li>
		<li>Adicionar o ácido fórmico (concentração final 26,4 mmol/L) e NH4OH (14,9 mmol/L) em cada fase móvel.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise qualitativa de SM por LC-ESI-MS3<ol>
<li>Ativar o sistema de cromatografia líquida (HPLC) de alto desempenho, colocar os tubos de entrada para as garrafas de vidro que contêm fases móveis e purgar as linhas HPLC. Link de uma coluna HPLC de18 C (1,5 mm identificação × 100 mm de comprimento, partícula tamanho 3,0 µm) para o sistema HPLC, manter a temperatura do forno da coluna, a 50 ° C e condicionar a coluna com a fase aquosa móvel em 100 µ l/min. colocar as amostras em um rack de amostra na autosampl -er.</li>
		<li>Defina os parâmetros do sistema de espectrometria de massa de linear ion trap quadrupolo para análise de3 MS conforme listado na tabela 1 e tabela 2 , bem como o precursor do primeiro e segundo íons das espécies de interesse SM e triplo quadrupolo.<ol>
<li>Dê um duplo clique no ícone do software para aquisição de dados, clique duas vezes a configuração de' Hardware', selecione 'LC + QTRAP4500 + válvula' e clique em 'Ativar perfil'.</li>
			<li>Crie uma nova subpasta clicando em 'Novo sub-projeto' e 'Okey'.</li>
			<li>Clique na guia 'arquivo', selecione 'Novo' e selecione 'Método de aquisição' e 'Okey'. Clique no ícone 'Mass Spec' e 'MS' Tab. Selecione Scan tipo como 'MS/MS/MS (MS3)', taxa de varredura como 10.000 Da/s, polaridade como 'Negativo' e 'Duração' como o tempo todo para ser analisado (min). Defina a m/z do 'Start (Da)' e 'Stop (Da)' como o intervalo a ser digitalizado. Defina a m/z dos iões precursor de 1ª e 2ª do alvo espécies SM de interesse. Nota: Para analisar várias espécies de SM, destacar o '-MS3' ícone, botão direito do mouse, selecione 'Copiar este experimento' e em seguida, colocar a m/z dos 1º e 2º iões precursor de outras espécies de SM.</li>
			<li>Selecione a guia 'Avançado MS' e definir cada parâmetro da seguinte forma: modo de varredura como 'Perfil', tamanho de passo como 0.12 (Da), resolução Q1 e Q3 'Unidade' e 'Iluminada', respectivamente, o limiar de intensidade como 0, tempo de solidificação como 50 (ms), pausa entre faixas de massa como 1,5 ms, selecione ' dinâmico preencher o tempo ', barreira de entrada Q3 como 8 V e o tempo de excitação como 25 ms.</li>
			<li>Clique no botão 'Editar parâmetros' na guia 'MS' e selecione 'fonte/gás' Tab definir os parâmetros do gás de cortina, gás de colisão, ionspray tensão, temperatura, íon fonte gas1 e gas2 conforme listado na tabela 1. Então selecione a guia 'Composto' definir os parâmetros do potencial declustering, potencial de entrada, energia, energia de excitação e energia de colisão espalhar conforme listado na tabela 2.</li>
			<li>Destaque 'Integrada da válvula Valco' e selecione 'Nome da posição para etapa 0' como A e 'B' como posição para total tempo 5,0 min. Também definido 'A' como posição para total tempo min 70,0.</li>
			<li>Destaca-se 'Sistema Shimadzu LC'. Selecione a guia 'Bomba' e definir o modo de bombeamento como fluxo binário, o fluxo total de 0,28 mL/min e o máximo de limites de pressão como 20,0 MPa. Selecione a guia 'Mostruário' e definir o volume de lavagem como 200 µ l agulha de traço como 52 milímetros, enxague a velocidade como 35 µ l/s, velocidade como 5,0 µ l/s de amostragem, purgar o tempo como 25,0 min, enxaguar o tempo de mergulho como 5 s e modo de lavagem como 'Antes e depois da aspiração'.<ol>
<li>Além disso, habilitar o aparelho refrigerador, regule a temperatura refrigerador como 4 ° C e o traço de agulha do frasco de controle como 52 mm. Selecione a guia 'Forno', permitem o forno e a temperatura do forno e a temperatura máxima definida como 50 ° C e 85 ° C, respectivamente.</li>
				<li>Seleccione o separador 'Controlador' e marque a caixa 'Ligar'. Seleccione o separador 'Programa' e defina os gradientes solventes como segue: solventes A / B na proporção de 100/0 por 5 min, programa lineares alterações de 80/20 mais de 4 min, 35/65 mais de 50 min e de 25/75 mais 1 min. depois , segurá-los no 25/75 por 10 min, em seguida linearmente para 100/0 mais 4 min. Então o método save.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Criar o arquivo de lote<ol>
<li>Duplo clique no ícone 'Construir lote de aquisição', clique em 'Adicionar Set', 'Adicionar a amostras', defina o número de novas amostras e clique em 'Okey'.</li>
			<li>Clique no botão ' método Editor' e selecione o método a ser usado. Se vários métodos são usados em um arquivo em lotes, marque a caixa de 'Uso múltiplo métodos' e selecione o método de aquisição para cada amostra. Renomear 'Nome da amostra', definir o número adequado para 'Posição de frasco' e coloque a quantidade de volume de injeção. Em seguida, salve o arquivo em lotes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Obter o produto de3 MS espectros de íons das espécies de interesse SM por LC-ESI-MS3 análise<ol>
<li>Selecione a guia 'Submeter' no arquivo de lote, destaca a linha de amostras a analisar e clique no botão 'Enviar'.</li>
			<li>Clique no ' View Quene' ícone, o ícone 'Equilíbrio', selecione o método de aquisição a ser utilizado, definir hora como 1 min e clique em 'Okey'.</li>
			<li>Desactive o 'Instrumento de reserva para Tuning', clicando no ícone correspondente. Em seguida, execute sequência em lote, clicando no ícone 'Começar a amostra'.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Atribuir a cada MS3 espectros de íon produto de SM, comparando a massa para cobrar proporção (m/z) do produto espectros de íons e a massa exata do esfingoides LCB e N-grupo acila de interesse. Determinar o número de carbonos e dois títulos no esfingoides LCB e N-grupo acila de acordo com os íons de produto correspondente.<ol>
<li>Verifique se a pasta apropriada sub-projeto foi selecionada, então dê um duplo clique no ícone 'Abrir arquivo de dados' e seleccionar as amostras a analisar. Arraste o pico no cromatograma, para cada espécie de SM de destino e clique duas vezes. Serão apresentados os obtidos espectros íon MS produto3 dentro da área arrastado.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise quantitativa de SM por LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Defina as fases móveis e HPLC coluna conforme descrito no passo 2.1 e 2.2.1.</li>
		<li>Defina os parâmetros do triplo quadrupolo e sistema de espectrometria de massa linear ion trap quadrupolo para múltiplas reação (MRM) análises de monitorização, conforme listado na tabela 1 e tabela 2.<ol>
<li>Realizar os procedimentos conforme descrito na etapa 2.2.2.1 e 2.2.2.2.</li>
			<li>Clique na guia 'arquivo', selecione 'Novo' e selecione 'Método de aquisição' e 'Okey'. Clique no ícone 'Mass Spec' e 'MS' Tab. Selecione Scan tipo como 'MRM', polaridade como 'Positivo'. Defina 'Duração' como o tempo todo para ser analisado. Defina a m/z de [M + H]+ e 184 como 'Massa de Q1 (Da)' e 'Q3 massa (Da)' do alvo espécies SM de interesse, respectivamente. Definir o 'Tempo' como 10 ms e 'ID' como o nome do alvo espécies de SM.</li>
			<li>Selecione a guia 'Avançado MS' e definir cada parâmetro da seguinte forma: ambos da resolução Q1 e Q3 como 'Unidade', limiar de intensidade como 0, definindo o tempo como 0 (ms) e pausa entre faixas de massa como 5 ms.</li>
			<li>Clique no botão 'Editar parâmetros' na guia 'MS' e selecione a guia ' Fonte/gás' colocar o parâmetro de gás de cortina, gás de colisão, ionspray tensão, temperatura, íon fonte gas1 e gas2 conforme listado na tabela 1. Em seguida, selecione a guia 'Composto' colocar os parâmetros de declustering potencial, potencial de entrada, energia de colisão e potencial de saída de célula de colisão conforme listado na tabela 2.</li>
			<li>Conjunto da válvula, conforme descrito na etapa 2.2.2.6.</li>
			<li>Defina a condição de LC, conforme descrito na etapa 2.2.2.7. Então o método save.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Crie o arquivo de lote, conforme descrito na etapa 2.2.3.</li>
		<li>Obter os dados MRM de cada espécie de SM por LC-ESI-MS/MS análise conforme descrito na etapa 2.2.4.</li>
		<li>Processar os dados MRM, usando o software de integração de dados e obter os dados da área do pico para o cromatograma de íons extraídos de cada espécie de SM.<ol>
<li>Dê um duplo clique no ícone do software para integração de dados em análise quantitativa, clique na guia 'Editar' e selecione padrões de integração do usuário. Definir largura liso Gaussian como 1,0 ponto e clique em 'Okey'. Clique na guia 'Editar' e selecione 'Nova tabela de resultados'. Selecione a amostra a ser integrada, clique em um botão de seta e clique em 'Avançar'. Selecione 'Criar novo método', defina o nome do método e clique em 'Avançar'. Clique em 'Avançar' e marque a caixa de d18:1 /(D31)-16:0 SM como está, clique em 'Avançar' e clique em 'Concluir'.</li>
			<li>Clique em 'Exibe a revisão de pico' e confirmar que os picos do cromatograma são reconhecidos adequadamente. Note-se que o tempo de retenção de d18:1 /(D31)-16:0 SM é geralmente menor por ~ 0,3 min em relação a um dos 34-1 SM (geralmente consiste de d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantificar a cada espécie de SM de acordo com a relação do pico de cada espécie de SM para o d18:1 /(D31)-16:0 padrão interno de SM.<ol>
<li>Clique na guia 'Arquivo', selecione 'Exportar', selecione 'Tabela de resultados', confirmando o formato do 'MultiQuant,' colunas 'Todas as colunas de exportação', linhas como 'Exportar todas as linhas exceto aqueles explicitamente ocultas' e clique em 'Okey'.</li>
			<li>Abra o arquivo exportado no software Excel. Normalizar a área do alvo espécies SM pela área de IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Então Multiplique pela quantidade teórica do IS na amostra injetada para calcular a quantidade de alvo espécies de SM na amostra injetada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Construir a curva padrão<ol>
<li>Obter os dados MRM de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM nas amostras para construir a curva padrão por LC-ESI-MS/MS análise, conforme descrito no passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obter os dados da área de pico de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM conforme descrito na etapa 2.3.5.</li>
		<li>Calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada como descrito no passo 2.3.6.</li>
		<li>Construir a linha de tendência, definindo os eixos x e y como o valor nominal e montante calculado de d18:1 /(D9)-18:1 SM e obter a fórmula de linha de tendência.</li>
	</ol></li>
	<li>Validando o método quantitativo, utilizando o software Excel<ol>
<li>Para validação do método, quantificar a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM no QC amostras, analisando cada QC da amostra pelo menos três vezes em 1 dia e repita pelo menos 3 dias, conforme descrito no passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obter os dados de área de pico e calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada como descrito no passo 2.3.5 e 2.3.6.</li>
		<li>De acordo com a curva de calibração obtida, calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada.</li>
		<li>Avaliação da precisão<ol>
<li>Calcular a média e o desvio padrão da quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM obtido na etapa 2.5.3 sobre o dataset do dia-intra e inter dia utilizando o software Excel.</li>
			<li>A média obtida na etapa 2.5.4.1 é dividida pelo desvio-padrão e expresso em %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avaliação da precisão<ol>
<li>Calcule a precisão de cada dados como segue: [(O montante calculado obtido na etapa 2.5.3.) / (Valor nominal) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Calcule a média do valor absoluto da precisão sobre o dataset do dia inter e intradia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases.">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li><li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery.">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li><li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+pathways,+functions,+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides.">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li><li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipidomics:+high-throughput,+structure-specific,+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li><li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3.">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li><li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin.">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS/MS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability,+data+quality,+and+assay+performance.">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+dissociation:+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions.">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li><li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry.">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li><li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry.">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li><li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry.">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

No presente método qualitativo, obtivemos MS3 íons de produto de um SPC e um N-grupo acila. É fundamental para atribuir adequadamente tanto um SPC e um N-grupo acila. Para este fim, note-se que outras moléculas contendo phosphorylcholine também podem ser detectadas como MS3 íons de produto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e plasmalogen-PC estão abundantemente presentes em células de mamíferos, e sua hidrofobicidade é similar de SM. Portanto, diacil-PC e PC-plasmalogen com um...

Esfingomielina (SM) é um comum esfingolipídeos em células de mamíferos. SM é sintetizada intracelular1 e presente como um precursor para outros esfingolipídeos como um esfingosina-1-fosfato e uma ceramida, que têm papéis cruciais em imune celular tráfico e homeostase da barreira, respectivamente,2, a pele 3. Assim, a análise precisa do metabolismo SM é importante para elucidar as funções fisiológicas e patológicas de esfingolipídeos.
SM é composto por uma ceramida e um phosphorylcholine que está vinculada ao grupo da ceramida, composto por mais uma esfingosina e um N1-hidroxi-grupo acila. Uma variedade do número de carbono e uma ligação dupla na esfingosina e N-grupo acila resulta na espécie número de ceramida (e SM). Avanços recentes na LC-ESI-MS/MS permitiu uma análise quantitativa e qualitativa de SM4,5. Na análise qualitativa, o número de carbono e ligações duplas de um esfingoides LCB de SM foi identificadas atribuindo espectros de íon produto da LCB. No entanto, informações estruturais do N-grupo acila não foram obtida diretamente porque seus íons correspondentes do produto não foram relatados e, portanto, N-metades de acila foram deduzidas pela análise diferencial entre íons precursor e íons de produto correspondente a LCB em ambos os modos de iões positivos e negativos4,5. Neste relatório, nós apresentamos um método para detectar os íons de produto da LCB e N-moiety de acila simultaneamente em modo de3 MS usando triplo quadrupolo e espectrometria maciça linear ion trap quadrupolo, que facilita a precisão estrutural especulação de cada espécie de SM6.
Os efeitos de supressão (ou aprimoramento) do íon causados pela matriz em amostras biológicas dificultam a quantificação exata na análise de LC-ESI-MS, e portanto, é desejável para construir as curvas de calibração para todos os analitos de interesse na matriz idêntica da amostra biológica. No entanto, esta estratégia não é viável porque é quase impossível preparar todas as espécies de SM em amostras biológicas, especialmente em uma análise abrangente. Assim, é prático para construir uma curva de calibração e determinar a escala quantitativa usando uma espécie de SM representante cravada nas amostras biológicas. Usamos duas espécies de SM desvendar-etiquetados para construir uma curva de calibração; foi usada para um padrão interno e outro para um padrão composto. Detectamos uma pequena quantidade de espécies de SM desvendar-rotulado como um padrão composto cravado em amostras biológicas e obtido com êxito uma curva de calibração e a escala quantitativa6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 2.0 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Test tube</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-lined screw cap</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Disposable glass tube</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &amp;micro;m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge holder</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Ammonia water</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (bath type)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer for glass test tube</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>8 mm septum</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum</td></tr><tr><td>Screw cap for 1.4 mm glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap with slit septum</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>The software for data acquisition and analysis of product ion spectra</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>The software for data integration in quantitative analysis</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylphosphorylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;rsquo;s minimum essential medium</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species

Apresentamos um método de analisar esfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente por cromatografia líquida-electrospray espectrometria de massa de ionização-em tandem (LC-ESI-MS/MS). SM é um esfingolipídeos comum, composto por um phosphorylcholine e uma ceramida como o componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Um número de espécies de SM está presente em células de mamíferos devido a uma variedade da esfingoides longa cadeia de base (LCB) e um N-moiety de acila na ceramida. Neste relatório, vamos mostrar um método de estimar o número de carbono e ligações duplas em uma LCB e um N-grupo acila baseia seus íons de produto correspondente em experimentos de MS/MS/MS (MS3). Além disso, apresentamos um método de análise quantitativa para SM usando duas estável desvendar rotulado SM espécies, que facilita a determinação do intervalo utilizado na quantificação da SM. O presente método será útil em caracterizando uma variedade de espécies de SM em amostras biológicas e produtos industriais como cosméticos.

Sintetizados quimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM em amostras de lipídios extraídas de células HeLa (Figura 1B) foram analisados por LC-ESI-MS3 empregando– [M + HCOO] e [M-CH3]- como íons precursor de primeiro e segundo, respectivamente. Observe que a intensidade de espectro de desmetilado-sphingosylphosphorylcholine (CPE) (<...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species at JoVE.com

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K visualizações.  Teikyo University. Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.

Vídeo: Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Bioengenharia

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Bioquímica

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS Análise de plaquetas humanas como uma plataforma para estudar mitocondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Ambiente

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Química

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether sphingolipids are altered in a disease and investigate whether sphingolipids can be targeted clinically. However, properly powered prospective studies that acquire tissues directly from the surgical suite can be time consuming, and technically, logistically, and administratively challenging. In contrast, retrospective studies can take advantage of cryopreserved human specimens already available, usually in large numbers, at tissue biorepositories. Other advantages of procuring tissues from biorepositories include access to information associated with the tissue specimens including histology, pathology, and in some instances clinicopathological variables, all of which can be used to examine correlations with lipidomics data. However, technical limitations related to the incompatibility of optimal cutting temperature compound (OCT) used in the cryopreservation and mass spectrometry is a technical barrier for the analysis of lipids. However, we have previously shown that OCT can be easily removed from human biorepository specimens through cycles of washes and centrifugation without altering their sphingolipid content. We have also previously established that sphingolipids in human tissues cryopreserved in OCT are stable for up to 16 years. In this report, we outline the steps and workflow to analyze sphingolipids in human tissue specimens that are embedded in OCT, including washing tissues, weighing tissues for data normalization, the extraction of lipids, preparation of samples for analysis by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS), mass spectrometry data integration, data normalization, and data analysis.

Sphingolipids are bioactive metabolites with well-established roles in human disease. Characterizing alterations in tissues with mass-spectrometry can reveal roles in disease etiology or identify therapeutic targets. However, the OCT-compound used for cryopreservation in biorepositories interferes with mass-spectrometry. We outline methods to analyze sphingolipids in human tissues embedded in OCT with LC-ESI-MS/MS.

Preparação de tecidos humanos incorporados em composto de temperatura de corte ideal para análise de espectrometria de massa

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

Pesquisa do câncer

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Biologia

Triagem de estruturas lipídicas usando marcação de isótopos estáveis

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Autor em destaque: Quantificação de amostras lipidômicas complexas usando marcação de isótopos estáveis

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

Resumo

Explore mais vídeos

PLAYLIST