Name: antimicrobial characterization of advanced materials for bioengineering applications
Uploaded: 2018-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
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Os autores gostaria de reconhecer a Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir para o apoio financeiro para este trabalho através da 001UCV-231-2017 e 2018-231-001UCV concede.

1. preparação da amostra
<ol><li>Corte as amostras de material em discos de diâmetro de 10 mm com um diâmetro de 10 mm soco cilíndrico. Nota: Materiais frágeis podem ser amaciados em solventes estéreis adequados para 1 h e corte em discos. Por exemplo, materiais hidrofílicos como alginato de zinco foram testados seguindo este protocolo e foram umedecidos em água esterilizada antes de cortá-los para evitar a ruptura da amostra. No entanto, outros materiais hidrofóbicos, como poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) não é necessário qualquer tipo de inchaço anterior a fim de ser devidamente cortado.</li>
	<li>Os discos de material de amostra a 60 ° C em um forno de vácuo a seco (< 10-2 Torr) por 24 h. Nota: Alguns materiais podem ser necessário uma alta temperatura de secagem. No entanto, é importante para não chegar a uma temperatura que termicamente pode degradar o material.</li>
	<li>Medir as espessuras de película de material com um paquímetro digital. Nota: Este protocolo recomenda a utilização de materiais filmes com espessuras constantes e semelhantes ao comparar a atividade antimicrobiana de diferentes materiais.</li>
	<li>Esterilize a cada amostra por imersão em etanol 70% por 10 min e subsequente radiação ultravioleta (UV) por 1h por cada lado. Nota: A radiação UV pode ser realizada colocando cada amostra em uma placa de Petri estéril dentro de uma capa de fluxo laminar com uma lâmpada W 12.0 da radiação UV-C. Atenção: Os pesquisadores não devem expor se à radiação UV, porque é mutagênico.</li>
	<li>Execute as etapas 1.1, 1.2, 1.3 e 1.4. com os discos de material de controle. Nota: Polietileno tereftalato (PET) ou materiais alternativos não-antimicrobiano podem ser usados como discos de controle no método de difusão e de contato. Além disso, quando caracterizar materiais tratados ou nanocompósitos, a matéria-prima deve ser usada como material de controlo.</li>
</ol>2. recomendados microorganismos
Nota: Recomendamos o uso de 3 diferentes microorganismos para estudar a capacidade antimicrobiana do material testado contra uma ampla gama de microorganismos.
<ol><li>Uso de culturas puras de 3 microorganismos: as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus, a bactéria Gram-negativa Escherichia colie a levedura Candida albicans. Nota: Outras espécies de microorganismos também podem ser testadas com este protocolo, modificando as condições de incubação, se necessário. Atenção: As medidas de biossegurança necessárias devem ser seguidas de acordo com o tipo de microorganismo empregado no presente protocolo.</li>
	<li>Trabalhar com material esterilizado ou pre-estéril e usar um queimador de Bunsen durante todo o processo de manipulação microbiana ou um gabinete de segurança biológica (se necessário) para assegurar condições assépticas. Nota: Autoclave recomendados são condições 121 ° C durante 15 min para meios de cultura e a 121 ° C durante 20 min. para o material de trabalho e resíduos biológicos.</li>
</ol>3. teste de difusão de disco ágar (método de difusão)
Nota: Quando uma difusão líquida de compostos antimicrobianos pode ser o principal mecanismo antimicrobiano de materiais avançados, o método de difusão pode fornecer informações muito úteis sobre a capacidade antimicrobiana desses materiais. O material disco localizado no centro da placa de ágar-ágar pode formar uma zona transparente anel (halo) onde uma inibição do crescimento de microorganismos ocorre após 24 h da cultura (ver Figura 1).
<ol><li>
Procedimento de teste de difusão
	<ol>
<li>Preparar e autoclave tryptic soy agar (TSA), seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Despeje o TSA em placas de Petri estéreis sob condições assépticas, utilizando um bico de Bunsen ou um capuz de fluxo laminar. Nota: As placas TSA devem ser de 4 – 6 mm de espessura.</li>
		<li>Cultura de microorganismos diferentes a ser testado por via aeróbia para 18-24 h nos pratos de Petri com TSA em uma incubadora a 37 ° C.</li>
		<li>Preparar e autoclave tryptic soy caldo (TSB), seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Despeje o TSB num tubo de centrífuga pré-esterilizados 50 mL com uma pipeta sorológica pré-esterilizados sob condições assépticas, utilizando um bico de Bunsen ou um capuz de fluxo laminar.</li>
		<li>Resuspenda algumas colónias de passo 3.1.3 em 25 mL de TSB contido num tubo de centrífuga estéril usando um cotonete estéril e vórtice por 1 min obter uma mistura uniforme.</li>
		<li>Ajustar a absorbância (a 540 nm) da cultura com um espectrofotômetro para o número apropriado de formadoras de unidades (UFC) por mL: aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL para bactérias e de 1 x 106 a 5 x 106 UFC/mL para o fermento. Nota: Os volumes de cultura e cubeta para medir a absorvância devem ser selecionados de acordo com o tipo de espectrofotômetro utilizado.</li>
		<li>O caldo microbiano durante 5 segundos para melhorar a dispersão de microorganismos e, brevemente, mergulhe um cotonete estéril na suspensão microbiana de vórtice. Remova o excesso de líquido da zaragatoa, pressionando-o contra a parede do tubo contendo a cultura.</li>
		<li>Uniformente marcam a suspensão microbiana caldo com o cotonete estéril para a superfície das placas TSA 3 aviões para cobrir toda a sua superfície com o microorganismo e deixe secar por 5 min após a inoculação. Nota: Para remover toda a umidade, as placas TSA devem ser colocadas abertas em posição invertida a 37 ° C por 10 a 15 min antes da inoculação.</li>
		<li>É necessário esterilize um par de pinças imergindo-os num copo de precipitação com etanol 96% e em seguida em chamas-lhes com um bico de Bunsen ou lamparina.</li>
		<li>Coloque os discos de amostra para serem testadas e controlar o disco no centro das placas TSA usando o par de pinças estéreis.</li>
		<li>Por via aeróbia, Incube as placas TSA em posição invertida a 37 ° C por 24 h. Nota: Para evitar qualquer risco de contaminação, é recomendável para incubar as placas TSA em posição invertida. No entanto, se o disco de amostra separa as placas TSA, não execute esta etapa em posição invertida. Nesse caso, recomenda-se secar as placas do capuz de fluxo laminar. Este teste antimicrobiano deve ser realizada pelo menos em quadriplicate em dias diferentes, para garantir a reprodutibilidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificação de pureza e concentração de suspensão microbiana Nota: As seguintes etapas são necessárias para verificar a concentração microbiana, determinada com o espectrofotómetro na etapa 3.1.7 correcta e certifique-se de que não havia nenhuma contaminação microbiana ambiental. Uma contaminação microbiana ambiental pode ser facilmente detectada pelo aparecimento de vários tipos de colónias microbianas após 24h de cultura. Além disso, não há contaminação microbiana do meio TSB durante sua manipulação nas diluições decimais seriais deve ser assegurada com uma placa de controle negativa TSB.<ol>
<li>Dispense o TSB estéril (preparado no passo 3.1.4) em tubos estéreis microcentrifuga utilizando uma micropipeta com pontas autoclavadas adequadas em condições assépticas. Um deles será utilizado como um controle negativo de TSB.</li>
		<li>Realize diluições decimais seriais com a suspensão microbiana caldo utilizada na etapa 3.1.9 nos tubos microcentrifuga estéril contendo TSB.</li>
		<li>Espalhou-se 100 µ l de cada diluição em placas TSA, usando uma espátula de Drigalski pré-esterilizados ou um instrumento alternativo. Também propagar-se 100 μL de meio TSB sem microorganismo (preparado na etapa 3.2.1) numa placa de TSA como uma placa de controle negativa TSB.</li>
		<li>Por via aeróbia, Incube as placas TSA aeróbia em 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Conte o número de colônias para verificar que o UFC/mL são semelhantes ao determinado na etapa 3.1.7.</li>
		<li>Verificar que não há nenhuma contaminação microbiana ambiental nas placas TSA com apenas um tipo de colônias.</li>
		<li>Verificar que não há nenhuma contaminação microbiana na placa de controle negativo TSB mostrando sem colônias</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medida da atividade antimicrobiana em superfícies Material (método de contato)
 Nota: Quando o contato de superfície pode ser o principal mecanismo antimicrobiano de alguns materiais avançados, o método de contato pode fornecer informações muito úteis sobre a capacidade antimicrobiana desses materiais. Neste método, os microrganismos são colocados diretamente sobre a superfície do material e sua inibição de crescimento pode ser determinada após um determinado período de tempo.
<ol><li>
Procedimento inicial
	<ol>
<li>Preparar e autoclave TSB seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Despeje o TSB num tubo de centrífuga pré-esterilizados 50 mL com uma pipeta sorológica pré-esterilizados sob condições assépticas, utilizando um bico de Bunsen ou um capuz de fluxo laminar.</li>
		<li>Cultura de microorganismos diferentes para serem testadas por via aeróbia pernoite no tubo com TSB em um agitador orbital (140 rpm) a 37 ° C.</li>
		<li>Diluir a cultura durante a noite em 20 mL de TSB num tubo de centrífuga pré-esterilizados 50ml a uma concentração de aproximadamente 106 UFC/mL (determinado com um espectrofotômetro a 540 nm). Nota: Os volumes de cultura e cubeta para medir a absorvância devem ser selecionados de acordo com o tipo de espectrofotômetro utilizado.</li>
		<li>Realize diluições em série decimais dessa cultura em tubos estéreis microcentrifuga contendo TSB. Espalhe a 100 µ l de cultura em placas TSA e incubá-lo por via aeróbia a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Contar o número de colônias para garantir uma concentração inicial de célula de aproximadamente 1 x 106 UFC/mL</li>
		<li>Coloque 4 discos de controlo para a contagem microbiana após 24 h e 4 discos de amostra de cada tipo dos materiais testados para a contagem microbiana após 24h em separa poços de uma placa estéril de 48.</li>
		<li>Pipete 150 µ l da suspensão microbiana para cada superfície de disco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microbiana, contando com o controle e materiais testados (após 24h)
	<ol>
<li>Após a etapa 4.1.6, incube por via aeróbia os 4 discos de amostra restante na placa de 48 a 37 ° C por 24 h. Nota: Este tempo de incubação 24 h pode ser modificado a fim de estudar a inibição de crescimento em momentos mais curtos ou mais longos.</li>
		<li>Após 24h de incubação, pipete 850 µ l de PBS estéril para a superfície os 4 discos de amostra e misturá-lo com a 150 µ l da suspensão microbiana.</li>
		<li>Recolher a mistura de suspensão microbiana/PBS e cada disco da placa de 48 e transfira para um tubo de 10 mL pré-esterilizados.</li>
		<li>Vórtice a mistura de suspensão microbiana/PBS e cada disco por 1 min, proceda à sonicação é a 50 Hz durante 5 min e vórtice novamente por 1 min assegurar que não há microorganismos viáveis se aderiu à superfície material.</li>
		<li>Realizar diluições decimais de série de cada cultura lisada em tubos estéreis microcentrifuga contendo TSB e espalhar 100 µ l de cultura em placas TSA e incubá-lo por via aeróbia a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Conte o número de colônias, que são o número de microorganismos viáveis em cada amostra e controle de superfície de disco. Expresse este número de células viáveis em (UFC/mL).</li>
		<li>Tire uma foto da cultura microbiana final para os discos de amostra e controle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. análise de resultados antimicrobiano
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg"> Figura 1: as medições para a largura normalizada do antimicrobiano "halo". Este painel mostra o diâmetro da zona de inibição (diz) e o diâmetro do disco (d). <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>
Análise de resultados de método de difusão
	<ol>
<li>Medir o diâmetro da zona de inibição (diz) e o diâmetro do disco (d) (ver Figura 1) com um paquímetro digital. Nota: A inibição zona ou antimicrobiano "halo" é formada como consequência da inibição do crescimento microbiano produzida pelo disco material antimicrobiano (ver Figura 1). É possível observar que existe uma zona de anel transparente perto da amostra em comparação com o resto da placa, onde os microorganismos têm crescido corretamente (zona opaca).</li>
		<li>Determine a largura normalizada do antimicrobiano "halo" (nwauréola) de cada disco, aplicando a equação (1). (1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg">
</li>
		<li>Determine a média e o desvio-padrão da largura normalizada dos antimicrobianos "halo" com os 4 determinado nwhalo valores de cada amostra.</li>
		<li>Tire uma foto da cultura microbiana final com o disco do material. Nota: O diâmetro da zona de inibição (diz) e o diâmetro do disco (d) podem também ser medidos a partir da fotografia tirada na etapa 5.1.4 usando uma software de processamento de imagem apropriada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de resultados do método de contato
	<ol>
<li>Determine o número de microorganismos viáveis, recuperado de acordo com a equação (2). (2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg"> Nota: Aqui, N é o número de microorganismos viáveis recuperado por cm2 por provete; C é a contagem de placa; D é o factor de diluição; A é a área da superfície da amostra em cm2 determinada com o diâmetro do disco de amostra.</li>
		<li>Determine a perda de viabilidade (LV) para refletir a inibição do crescimento celular, aplicando a equação (3). (3)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg"> Nota: Aqui, C é o número médio de microorganismos viáveis (N) em CFU/mL•cm2, recuperadas as amostras de controle após 24 h; S é o número de microorganismos viáveis (N) em CFU/mL•cm2, recuperadas os provetes após 24 h.</li>
		<li>Determine a média e o desvio-padrão da perda de viabilidade com 4 valores LV(%) determinados de cada amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-induced+polymerisation+of+hydrophilic+coatings+onto+macroporous+hydrophobic+scaffolds.">Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds.</a> Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Rault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+analysis+of+water+in+reinforced+plasma-polymerised+poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).</li><li>Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego-Ferrer, G., SuayAnt&#243;n, J., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+water+and+polymer+chains+in+poly(hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+crosslinking+on+porous+poly(methyl+methacrylate)+produced+by+phase+separation.">Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation.</a> Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).</li><li>Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego Ferrer, G., Suay Ant&#243;n, J., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly+(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroporous+poly(methyl+methacrylate)+produced+by+phase+separation+during+polymerisation+in+solution.">Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution.</a> Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+and+water+vapour+sorption+of+highly+porous+poly(methyl+methacrylate).">Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate).</a> Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+prepared+by+radical+polymerisation+with+methanol+as+diluent.">Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent.</a> Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).</li><li>Rodr&#237;guez-Hern&#225;ndez, J. C., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+nanocomposite+scaffolds+with+ordered+cylindrical+orthogonal+pores.">Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores.</a> J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).</li><li>Br&#237;gido-Diego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylic+scaffolds+with+interconnected+spherical+pores+and+controlled+hydrophilicity+for+tissue+engineering.">Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering.</a> J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+water+diffusion+and+compression+performance+of+crosslinked+alginate+with+a+minuscule+amount+of+graphene+oxide.">Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide.</a> Sci Rep. 7, 11684 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+irregular+graphene+oxide+tubes+using+green+chemistry+and+their+potential+use+as+reinforcement+materials+for+biomedical+applications.">Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications.</a> PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).</li><li>S&#225;nchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+reinforced+with+graphene+oxide:+Remarkable+improvement+of+water+diffusion+and+mechanical+properties.">Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties.</a> J Appl Polym Sci. , (2018).</li><li>Serrano-Aroc, &. #. 1. 9. 3. ;., Iskandar, L., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+synthetic+routes+to+alginate-graphene+oxide+composite+hydrogels+with+enhanced+physical+properties+for+bioengineering+applications.">Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications.</a> Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).</li><li>Llorens-G&#225;mez, M., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Advanced+Hydrogels+of+Calcium+Alginate/Carbon+Nanofibers+with+Enhanced+Water+Diffusion+and+Compression+Properties.">Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties.</a> Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).</li><li>Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+testing+by+a+standardized+single+disk+method.">Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method.</a> A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).</li><li>Taubes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteria+fight+back.">The bacteria fight back.</a> Science. 321 (5887), 356-361 (2008).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10+x+'20+progress--development+of+new+drugs+active+against+Gram-negative+bacilli:+an+update+from+the+infectious+diseases+society+of+America.">10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A atividade antimicrobiana dos novos materiais avançados pode ser analisada pelo presente protocolo fácil de seguir, consistindo de 2 procedimentos complementares com base em 2 métodos existentes: a difusão do disco de ágar teste38 e a atividade antimicrobiana medido na superfícies de materiais de acordo com a ISO 22196:2007 norma39.
Neste campo de pesquisa, muitos dos testes antimicrobianos relatados na literatura são altamente dependentes do ensaio. Portanto, é muito importante para ter detalhado e consistente protocolos no lugar através de laboratórios. Este artigo é um passo nessa direção. Além disso, pode ser muito útil para muitos pesquisadores que são menos experientes neste campo e requerem procedimentos em profundidade, passo a passo a seguir para obter resultados precisos.
Este protocolo pode ser usado com vários tipos de materiais cortados em formas de disco de 10 mm de diâmetro. Materiais frágeis podem estar inchados em um solvente adequado para 1h processar o processo de corte mais fácil. Assim, materiais hidrofílicos como alginatos podem ser hidratados em água destilada esterilizada. Outros solventes, como álcool, cetona e diclorometano, podem ser empregados para inchar materiais hidrofóbicos para 1h antes de cortá-los. No entanto, alguns materiais tais como poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) não precisa ser inchado e podem ser cortados diretamente. Depois disso, é muito importante secar os discos de material de amostra em um forno a vácuo e esterilizar cada amostra com etanol e radiação UV por 1h para evitar qualquer risco de contaminação.
Este protocolo recomenda TSA e TSB como meios de cultura e o uso de culturas puras de 3 microorganismos para alcançar uma ampla gama de microorganismos: as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus, a bactéria Gram-negativa Escherichia coli, e a levedura Candida albicans. No entanto, meios de cultura alternativos e outros microorganismos que necessitam de condições de incubação diferentes também poderiam ser usados com este protocolo. Às vezes, apenas 1 microorganismo é testado para ter uma ideia inicial da atividade antimicrobiana de um novo material.
Os materiais mostrando forte atividade antimicrobiana contra o recomendado 3 diferentes tipos de microorganismos também devem ser testados contra patógenos resistentes aos antibióticos como resistente à meticilina Staphylococcus epidermidis (MRSE), que têm sido utilizados com sucesso com este protocolo. Outros importantes microorganismos resistentes aos medicamentos que estão causando muita preocupação são as Gram-positivas resistentes à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA) e resistentes à vancomicina enterococos (VRE) e as Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa40,,41.
Inibição de biofilme e a atividade antimicrobiana dos materiais contra outros tipos de microorganismos como vírus e parasitas, não podem ser testados com este protocolo. No entanto, este protocolo fornece um ponto de partida muito útil para um estudo antimicrobiano de um novo material avançado.
No teste de difusão de ágar antimicrobiana disco, uma etapa crítica ocorre quando o disco de amostra tem que ser colocado no centro da placa, porque alguns materiais dobram tão logo eles entrar em contato com a mídia de ágar. Neste caso, é recomendável usar um estéril par de pinças para desdobre cuidadosamente a amostra. Por outro lado, o método de contato, é fundamental para o controle de lavar e discos de amostra muito bem com PBS pipetando-los quatro vezes seguido por um vigoroso num Vortex e sonication para garantir que não há microorganismos viáveis permanecem aderidos ao material superfície.
Este protocolo de vídeo pode ser utilizado em muitas aplicações de bioengenharia, tais como engenharia de Bioprocessos, engenharia de tecidos, administração de medicamentos controlados, materiais de embalagem, tratamento de águas residuais e agricultura, que use biomateriais com um altamente desejável capacidade antimicrobiana.
Os resultados obtidos com este protocolo são qualitativos (as imagens) e quantitativo (a largura normalizada do antibacteriano "halo" e a perda de viabilidade) com uma boa análise da sua reprodutibilidade (média ± desvio-padrão). Ao comparar diferentes materiais, estes valores médios obtidos com a análise de resultados de método de difusão e de contato devem ser analisados por ANOVA One-Way, seguido de análise post hoc da Turquia, a fim de estudar se eles são, estatisticamente, significativamente diferentes (p < 0,01).

Falha de implante é uma consequência de infecções microbianas que ocorrem apesar da profilaxia antimicrobiana e condições de trabalho asséptico. Esse problema está causando muito elevados custos de saúde e é angustiante entre pacientes1. Importante bactérias como Staphylococcus aureus são atualmente consideradas muito perigosos patógenos em infecções nosocomiais associadas a cateteres e outros implantes médicos e são os principais contaminantes de instrumentos médicos,2. Portanto, o desenvolvimento de estratégias de antimicrobianos romance é urgentemente necessária para utilizações diárias e médicas.
Agentes antimicrobianos incluem antibióticos3, compostos de amónio quaternário4, íons/óxidos de metal5e peptídeos antimicrobianos (AMPs)6. Os antibióticos estão tornando-se gradualmente menos eficientes devido à resistência bacteriana7, que está a aumentar devido ao uso excessivo de antibiótico8. Quaternários de amônio são apenas muito eficientes para um uso a curto prazo por causa da resistência microbiana9. Íons/óxidos de metal muito tempo têm sido utilizados como agentes antimicrobianos muito eficazes e são usados em muitos produtos comerciais comuns, incluindo ligaduras, filtros de água, tintas, etc.10,11,12. No entanto, foi demonstrado que estes tipos de compostos podem ser tóxicos para alguns tipos de células de mamíferos,13.
Ampères mostram excelente antimicrobiano e imunomodulador propriedades14,15, e bactérias parecem achar muito difícil desenvolver uma resistência contra os16. No entanto, o processo para produzir puros AMPs é caro; Portanto, uma produção em grande escala não é viável. Assim, estratégias para combater os problemas na produção de amplificadores têm sido desenvolveram (por exemplo, pequenas peptoid antibacteriana molecular imita17, peptoids18, α-peptídeos19 e peptídeos β20). Polypeptoids e metacrilato-terminou polipeptídeos foram sintetizados para revestimentos de antimicrobianos e anti-incrustantes21.
O desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos, tais como materiais avançados em puro ou de forma híbrida, capaz de prevenir e tratar infecções multirresistentes, é cada vez mais necessária. Uma ampla gama de novos materiais avançados para muitos campos da bioengenharia como tecido e engenharia de Bioprocessos foram desenvolvidos com propriedades físicas e químicas melhoradas nas últimas décadas através de vários métodos: plasma-polimerização de enxerto para um substrato hidrofóbico22,23,24, alfaiataria de reticulação densidade25,26, polimerização em solução27,28,29 , 30,31,de dissolução porogen32e pela incorporação de nanomateriais como grafeno óxido (GO)33,34,35,36 e carbono de nanofibras (CNFs)37.
O estudo da capacidade antimicrobiana destes novos materiais poderia aumentar exponencialmente a sua aplicabilidade potencial de bioengenharia e, portanto, tornou-se essencial. Apresentamos um protocolo fácil de seguir para quantificar a atividade antimicrobiana de tais novos materiais avançados. Aqui, após a preparação da amostra, dois métodos complementares são seguidos: o primeiro baseia-se o ágar disco difusão teste38 (método de difusão) e o segundo é baseado na ISO 22196:2007 norma39 para medir a atividade antimicrobiana em superfícies de material (método de contato).

<table><tbody><tr><td>Cylindrical punch&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 mm diameter</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>soria genlab</td><td>P101</td><td>90 mm diameter, sterile</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar (TSA)</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Sterile cotton swab</td><td>EUTOTUBO</td><td>300200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL, sterile</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>Absolute ethanol</td></tr><tr><td>Sterile 48-wells plate</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene</td></tr><tr><td>A pair of tweezers</td><td>BRAUN</td><td>24612036</td><td>Toothless</td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS).</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum oven with a connected vacuum pump</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>12.0 W lamp of UV-C radiation</td></tr><tr><td>Class II Biological safety cabinet</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Macherey-Nagel, Germany</td><td>Nanocolor UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol burner</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>sartorius stedim</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>Digital calliper</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>25 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL, sterile</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>FA10005P</td><td>Pipetman L P200L, plastic 20-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>Pipetman P1000, 200-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td>FA10016</td><td>Pipetman L P12X300L, 20-300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Pre-sterilized tube&amp;nbsp;</td><td>INSULAB</td><td>301402</td><td>10 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Photo camera</td><td>Canon EOS 5D</td><td></td><td>Any camera with high resolution can also be utilized</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td></td><td>&amp;nbsp;strain V329</td><td>Cucarella et al. &lt;em&gt;J Bacteriol&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;183 (9)&lt;/strong&gt;,&amp;nbsp; 2888&amp;ndash;2896 (2001)</td></tr><tr><td>Gram-negative bacteria &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 101</td><td></td></tr><tr><td>Yeast &lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 1394</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer-cuvettes</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4,5 mL</td></tr><tr><td>Drigalski spatula</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>Sterile, disposable&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>glass balls (2 mm diameter)</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula</td></tr><tr><td>Autoclave bags</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>To sterilize microbiological residues or contaminated material</td></tr><tr><td>Electronic pipette filling device</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>Indicator tape for sterilization</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.</td></tr><tr><td>Universal test tube rack</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>To hold centrifuge tubes</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube rack</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>To hold microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Sterile loop</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>10 &amp;micro;L of capacity for microbial culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M1</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M2</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M3</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type3</td></tr><tr><td>Material M4</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material C</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Control material</td></tr></tbody></table>

antimicrobial characterization of advanced materials for bioengineering applications

O desenvolvimento de novos materiais avançados com propriedades de reforçadas está se tornando cada vez mais importante em uma ampla gama de aplicações de bioengenharia. Assim, muitos novos biomateriais estão sendo projetados para imitar ambientes específicos necessários para aplicações biomédicas, tais como a engenharia de tecidos e administração de medicamentos controlados. O desenvolvimento de materiais com propriedades melhoradas para a imobilização de células ou enzimas também é um tópico de pesquisa atual em engenharia de Bioprocessos. No entanto, uma das propriedades mais desejáveis de um material nestas aplicações é a capacidade antimicrobiana para evitar quaisquer infecções indesejáveis. Por isso, apresentamos fácil de seguir protocolos para caracterização de materiais com base em (i) o teste de difusão de disco de ágar (método de difusão) e (ii) a norma de 22196:2007 ISO para medir a atividade antimicrobiana em superfícies materiais (contato antimicrobiana método). Este protocolo deve ser executado usando bactérias gram-positivas e Gram-negativas e leveduras para cobrir uma ampla gama de microorganismos. Por exemplo, 4 materiais com diferentes naturezas químicas são testados seguindo este protocolo contra Candida albicans, Escherichia colie Staphylococcus aureus. Os resultados destes testes apresentam atividade antimicrobiana-não para o primeiro material e aumento da atividade antibacteriana contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas para os outros 3 materiais. No entanto, nenhum dos 4 materiais são capazes de inibir o crescimento de Candida albicans.

Este protocolo foi utilizado, por exemplo testar a capacidade antimicrobiana de 4 materiais com diferentes naturezas químicas contra os 3 recomendado microorganismos: Escherichia coli, Staphylococcus aureuse Candida albicans . Os resultados dos testes de difusão de disco de ágar (método de difusão) exibiram atividade antimicrobiana-não para o primeiro material (M1), como ocorreu no disco de controle (C, a imagem não é mostrada) e aumento da atividade antibacteriana contra Gram-positivas e Gram-negativas bactérias para os outros 3 materiais M2, M3 e M4 (ver Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg"> Figura 2: resultados do método de difusão antimicrobiana. Este painel mostra o método de difusão antimicrobiana para os material (M1, M2, M3 e M4) 4 discos (diâmetro 10 mm x 1 mm de espessura) contra s. aureus e e. coli após 24 h de incubação. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 3 mostra as diferentes larguras normalizadas do antimicrobiano "halo" (nwhalo) para os exemplo diferentes materiais M1, M2, M3 e M4 contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas calculado com a equação (1). No entanto, nenhum dos 4 materiais foram capazes de inibir o crescimento da levedura Candida albicans (imagens não mostradas).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg"> Figura 3: resultados de difusão antimicrobiana "halo". Este painel mostra o normalizado "halo" (nwhalo) para cada material (M1, M2, M3 e M4) disco (diâmetro 10 mm x 1 mm de espessura) contra s. aureus e e. coli após 24 h de incubação. As diferenças são estatisticamente significativas (p < 0,01). No entanto, a amostra M1 não exibiu nenhuma atividade antimicrobiana. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os resultados do método contato também exibiram atividade antimicrobiana-não para o primeiro material (M1), como ocorreu no disco de controle (C) e crescente atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas para os outros 3 materiais (ver e serem A Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg"> Figura 4: antimicrobianos entre em contato com os resultados do método. Este painel mostra as placas respectivas 90mm do 4 material (M1, M2, M3 e M4) superfície atividade antimicrobiana ensaio de acordo com a ISO 22196:2007 após 24 h de incubação para S. aureus e Escherichia coli (factor de diluição de 10-4). C é a bactéria viável recuperada o disco de controle após 24 h de incubação. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A perda de viabilidade (%) foi determinada pela equação (2) e (3), conforme indicado no presente protocolo (ver Figura 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg"> Figura 5: perda de viabilidade pelo método de contato. Este painel mostra a perda de viabilidade (%) de M1, M2, M3 e M4 contra S. aureus e e. coli na superfície do material. Amostra M1 não exibiu nenhuma atividade antimicrobiana. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
No entanto, nenhum dos 4 materiais foram capazes de inibir o crescimento da levedura Candida albicans pelo método de contato de qualquer (imagens não mostradas). Portanto, 3 destes 4 materiais avançados mostrou resultados positivos antimicrobianos contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas e, portanto, pode ser muito útil para muitas aplicações de bioengenharia com requisitos de alta atividade antibacteriana. No entanto, nenhum dos 4 materiais foram capazes de inibir o crescimento de levedura.

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Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Apresentamos um protocolo para a caracterização antimicrobiana de materiais avançados. Aqui, a atividade antimicrobiana em superfícies do materiais é medida por dois métodos que se complementam: uma baseia-se no teste de difusão de disco de ágar-ágar, e o outro é um procedimento padrão com base na norma ISO 22196:2007.

Antimicrobiana caracterização de materiais avançados para aplicações de bioengenharia

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.9K visualizações.  Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir. Apresentamos um protocolo para a caracterização antimicrobiana de materiais avançados. Aqui, a atividade antimicrobiana em superfícies do materiais é medida por dois métodos que se complementam: uma baseia-se no teste de difusão de disco de ágar-ágar, e o outro é um procedimento padrão com base na norma ISO 22196:2007.

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High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Bioengenharia

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Imunologia e Infecção

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Síntese de nanotubos de carbono de paredes Multi modificados com nanopartículas de prata e avaliação das suas actividades antibacterianas e propriedades citotóxicas

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been explored previously in clinical and environmental settings and in consumable food products. However, a lack of consistency in the experimental methods and materials used has culminated in conflicting results, even amongst studies of the same nanostructure types and bacterial species. For researchers who wish to employ nanostructures as an additive or coating in a product design, these conflicting data limit their utilization in clinical settings. 
To confront this dilemma, in this article, we present four different methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, and discuss their applicability in different scenarios. Adapting consistent methods is expected to lead to reproducible data that can be compared across studies and implemented for different nanostructure types and microbial species. We introduce two methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and two methods for the antimicrobial activities of nanostructured surfaces. 
For nanoparticles, the direct co-culture method can be used to determine the minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations of nanoparticles, and the direct exposure culture method can be used to assess real-time bacteriostatic versus bactericidal activity resulting from nanoparticle exposure. For nanostructured surfaces, the direct culture method is used to determine the viability of bacteria indirectly and directly in contact with nanostructured surfaces, and the focused-contact exposure method is used to examine antimicrobial activity on a specific area of a nanostructured surface. We discuss key experimental variables to consider for in vitro study design when determining the antimicrobial properties of nanoparticles and nanostructured surfaces. All these methods are relatively low cost, employ techniques that are relatively easy to master and repeatable for consistency, and are applicable to a broad range of nanostructure types and microbial species.

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

We introduce four methods to evaluate the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces using in vitro techniques. These methods can be adapted to study the interactions of different nanoparticles and nanostructured surfaces with a broad range of microbial species.

Avaliação da atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas in vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

Geração de maior biomassa de biofilme bacteriano usando dispositivos microplacas de poço profundo pcr-placa

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Óxido de grafeno antibacteriano/nanocompósitos de cobre para bactérias resistentes

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to antibiotics. Developing&#160;antimicrobial agents that can replace existing antibiotics is essential because antibiotic-resistant bacteria have resistance mechanisms for all current antibiotics and can promote nosocomial infections. To address this challenge, in this study, we propose graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as antibacterial materials that can replace the existing antibiotics. GO/Cu nanocomposites are characterized by transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. They show that copper (Cu) nanoparticles are well-grown on the graphene oxide sheets. Additionally, a microdilution broth method is used to confirm the efficacy of the antimicrobial substance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), which are frequently implicated in nosocomial infections. Specifically, 99.8% of MRSA and 84.7% of P. aeruginosa are eliminated by 500 &#181;g/mL of GO/Cu nanocomposites. Metal nanocomposites can eradicate antibiotic-resistant bacteria by releasing ions, forming reactive oxygen species, and physically damaging the bacteria. This study demonstrates the potential of antibacterial GO/Cu nanocomposites in eradicating antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Nanocompósitos metálicos para eliminar bactérias resistentes a antibióticos

Herein, we introduce graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as an antibacterial nanomaterial. The antibacterial effectiveness of the GO/Cu nanocomposites was evaluated against both antibiotic-resistant gram-positive and gram-negative bacteria.

Fabricação de Nanocompósitos Antibacterianos de Óxido de Grafeno/Cobre

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...

<meta charset="utf8"></head><body> Síntese de nanopartículas de óxido de zinco e análise de seus efeitos antibacterianos

Preparation of Zinc Oxide Nanoparticles and the Evaluation of their Antibacterial Effects

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant bacterial strains in hospitals has been attributed to the extensive and varied use of antibiotics, further exacerbating the problem of antibiotic resistance. Metal nanomaterials have been widely studied as an alternative solution for eradicating antibiotic-resistant bacterial cells. Metallic nanoparticles attack bacterial cells through various mechanisms, such as the release of antibacterial ions, generation of reactive oxygen species, or physical disruption, against which bacteria cannot develop resistance. Among the actively researched antimicrobial metal nanoparticles, zinc oxide nanoparticles, which are FDA-approved, are known for their biocompatibility and antibacterial properties. In this study, we focused on successfully developing a precipitation method for synthesizing zinc oxide nanoparticles, analyzing the properties of these nanoparticles, and conducting antimicrobial tests. Zinc oxide nanoparticles were characterized using transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS), ultraviolet/visible spectroscopy, and X-ray diffraction (XRD). Antibacterial tests were conducted using the broth microdilution test with the multidrug-resistant strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa. This study demonstrated the potential of zinc oxide nanoparticles in inhibiting the proliferation of antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Explorando os efeitos antibacterianos das nanopartículas de óxido de zinco na superação da resistência a antibióticos

In this study, zinc oxide nanoparticles were synthesized using a precipitation method. The antibacterial effect of the synthesized particles was tested against multidrug-resistant methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa bacterial strains.

Preparação de nanopartículas de óxido de zinco e avaliação de seus efeitos antibacterianos

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant ...

Antimicrobiana caracterização de materiais avançados para aplicações de bioengenharia

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