Na natureza, Cas9 é uma proteína imune contra vírus invasores que a evolução prefere Cas9 com especificidade promíscua que pode cortar DNA viral com mutações espontâneas. Construímos um sistema de evolução artificial que prefere uma variante Cas9 otimizada com alta especificidade. Ambas as seleções negativas e positivas funcionam simultaneamente no Sistema de Triagem de Atiradores.
As variantes Cas9 com atividade off-target reduzida também mantendo a atividade no alvo podem ser examinadas de uma só vez. Mutações foram introduzidas em toda a sequência Cas9 aleatoriamente para produzir a biblioteca a ser rastreada. E isso tornou possível encontrar mutações em posições inesperadas.
Atualmente, muitos pesquisadores da academia e da indústria estão usando o Tipo Y Cas9 para desenvolvimentos terapêuticos. No entanto, a especificidade do Cas9 tipo Y não é otimizada, o que pode resultar em off bem embalado. Em humanos, isso significa mutações inesperadas em genes aleatórios, o que pode levar a sérios efeitos colaterais.
Existem muitas cas9 como enzimas que estão sendo desenvolvidas na terapêutica. Nossa técnica pode ser usada para melhorar a especificidade de outros DNA e nucleídeos como Jipinger, Tailândia e Cas9 também, como CPF1. Fazer uma biblioteca grande o suficiente é a chave para aumentar as possibilidades de obter uma variante com função importante.
Certifique-se de obter uma alta eficiência na etapa de resfriamento, e use células altamente eficientes e competentes. Para iniciar este procedimento, adicione um nanograma do plasmídeo CCDB e do plasmídeo SGRNA com duplos desencontros em cinquenta microliters de células GOI descongeladas. Misture suavemente as células por pipetação, e transfira-as para uma cuvette de eletroporação pré-refrigerada de 0,1 centímetro.
Transforme o E-coli com os dois plasmídeos via eletroporação. Imediatamente após a eletroporação ser concluída, adicione 250 microliters de meio SOC. Pipeta suavemente a solução para misturar as células e o meio, e transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Recupere as células transformadas e incuba-as a 32 graus Celsius, com agitação suave por uma hora. Continue preparando as células de triagem Snyper conforme descrito no protocolo de texto. Quando estiver pronto para realizar a triagem de Snyper, transforme as células de triagem Snyper com 100 nanogramas dos plasmídeos preparados da variante Cas9 de cada biblioteca usando o processo de elctroporação que foi descrito anteriormente.
Em seguida, transfira 250 microliters das células para um tubo fresco de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 250 picogramas de ATC a uma concentração final de 10 nanogramas por mililitro. Recupere as células que contêm ATC e as atc, incubando-as a 32 graus Celsius durante uma hora com agitação suave.
Placa 25 microliters das células livres de ATC recuperadas em uma placa de ágar LB, contendo clorofenicol e kanamycina. Adicione ATC ao ATC recuperado contendo células a uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro em uma placa de ágar de 245 milímetros LB. Emplaque imediatamente as células contendo ATC em um ágar LB contendo placa contendo clorofenicol, kanamicina e arabinose.
Incubar todas as placas durante a noite a 32 graus Celsius. No dia seguinte, fotografe as placas. Usando o software de CFU aberto, conte o número de colônias viáveis, certificando-se de que o número de colônias na placa não-seletiva seja pelo menos dez vezes maior do que a diversidade da biblioteca, para cobrir todas as variantes.
Puxe as colônias que sobreviveram nas placas seletivas das três bibliotecas. Transfira essas colônias agrupadas para 250 mililitros de meio LB, suplementados com clorofenicol, e incubar durante a noite a 42 graus Celsius. Primeiro, carregue o software cas of finder para escolher sites de destino.
Selecione o tipo PAM apropriado para o tipo específico de Cas9 e o genoma alvo. Preencha a guia sequências de consulta. Escolha o número de incompatibilidade e clique no botão enviar.
Após alguns segundos, os locais no alvo e fora do alvo aparecerão. Em geral, escolha os locais fora do alvo com um ou três desencontros. Em seguida, solicite o CRRNA e o Track RRNA oligos com sequências de modelo e amplie o modelo conforme descrito no protocolo de texto.
Analise dois microliters do DNA do modelo amplificado, em um gel de 2%agarose e, em seguida, purifique o modelo. Incubar a mistura de reação durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 0,5 microliters de DNAse e incubar a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos, e depois purificar o SGRNA.
Em seguida, trate 10 microgramas do RNA transcrito in vitro com 250 unidades de fosfatase alcalina intestinal da panturrilha por três horas a 3 graus Celsius, na presença de 100 unidades do inibidor RNAse, e depois purifique o SGRNA tratado. Primeiro, manter as células HEK293 T no DMEM suplementadas com 10% de FBS e 1% antibióticos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, misture dois microgramas de qualquer tipo selvagem ou proteína Snyper Cas9 com dois microgramas de SGRNA, e incubar em temperatura ambiente por dez minutos para fazer complexos RNP.
Trypsinize e conte as células, depois lave-as e prepare-as em tampão de eletroporação conforme descrito no protocolo de texto. Eletroporar os complexos RNP nas células usando um pulso de 1300 volts por 30 milissegundos. Imediatamente após a eletroporação, emplaque as células em uma placa de 48 poços preenchida com 500 microliters de DMEM, suplementada com 10% FBS e 1%antibióticos.
Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Manter as células HEK293 T no DMEM suplementadas com 10% de FBS e antibióticos de 1% a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Um dia antes da transfecção, tentepsinizar e contar as células.
Se trabalhar em uma escala de 48 poços, placa 10.000 células por poço e 250 microliters de meio de crescimento completo. Usando um reagente de transfecção à base de lipídio, prepare 250 nanogramas de plasmídeo P3S Cas9 e 250 nanogramas de SGRNA para transfecção. Em seguida, misture os plasmídeos em 25 microliters de MEM sem soro.
Diluir um microliter de reagente de transfecção com 25 microliters de MEM sem soro. Incubar esta mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Combine a mistura plasmida com a mistura de reagente de transfecção e incubar no quarto por 20 minutos para formar complexos lipofectamina plasmídeos.
Depois disso, adicione 50 microliters desta mistura diretamente a cada poço contendo células. Balance suavemente a placa para frente e para trás para misturar. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 48 a 72 horas após a transfecção, antes de avaliar a expressão transgênica.
Depois de isolar o DNA genômico previamente preparado, gerar bibliotecas de sequenciamento profundo por amplificação PCR do GDNA com primers voltados para o alvo e fora do alvo. Em seguida, use primers de índice para rotular cada amostra. Use uma máquina de sequenciamento de próxima geração para submeter as bibliotecas da piscina a sequenciamento final emparelhado.
Após a realização da tela de Snyper, a porcentagem de colônias de sobrevivência pode ser calculada dividindo o número de colônias na placa de LB seletiva pelo número de colônias na placa LB não-seletiva. Embora essa porcentagem seja geralmente muito baixa quando realizada com bibliotecas de SP Cas9, verdadeiros acertos positivos podem ser enriquecidos repetindo a tela com o pool sobrevivente. Uma tela Snyper representativa mostra que uma taxa de sobrevivência de 100% é obtida após a terceira tela.
Transfecções usando RNPs ou plasmid codificado Snyper Cas9 podem ser feitas para vários alvos, e as atividades de alvo e fora do alvo resultantes medidas pelo sequenciamento de amplicon alvos. Na maioria dos alvos, O Snyper Cas9 mostra o mesmo nível de atividades-alvo e maiores razões de especificidade em comparação com o tipo selvagem. SGRNAs truncadas também podem ser usados para melhorar ainda mais a especificidade.
Maior eficiência de transformação na primeira etapa de limpeza é muito importante não perder os clones com alta especificidade. As etapas de triagem posteriores repetem menos eficiência de transformação, uma vez que os clones já são enriquecidos na primeira etapa de triagem, e há menos chance de perdê-los. Haverá mais de um clone que encontramos na tela do Snyper.
As atividades on-target e fora do alvo desses clones devem ser caracterizadas em tantos alvos diferentes quanto possível para selecionar clones com o melhor desempenho. Com este método, os cientistas podem melhorar a especificidade das enzimas semelhantes a Cas9 sem perda de atividade no alvo. Além disso, os cientistas não precisam de nenhum conhecimento prévio sobre a estrutura da proteína para fazer melhorias.
