RNAs não codificadoras geralmente têm isoforms múltiplos. Em estudos in vitro de superexpressão, muitas vezes é difícil estudar todas essas isoformas expressas. Esta técnica permite que os usuários obtenham expressão diretamente do genoma e permitam que as células expressem as isoformas endógenas para um RNA não codificador específico.
Esta técnica poderosa permite que o usuário direcione especificamente a expressão de qualquer gene no genoma com fidelidade e precisão. Ao projetar o guia RNAs para genes específicos, é capaz de usar as máquinas endógenas de splicing de genes para expressar as isóformas naturais em uma determinada célula. Demonstrando o procedimento será Robert Rankin, um pós-doutor do meu laboratório.
Para projetar a sequência de RNA guia que está localizada dentro de 100 pares base do local de início transcricional, use bancos de dados genéticos como o BLAT para garantir que o RNA guia seja exclusivo do gene de interesse. Armazene o guia RNA e os plasmídeos Cas9 desativados a quatro graus Celsius. Passe e.coli em uma placa de ágar de caldo de Luria com ampicillina e cresça a bactéria durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, escolha uma colônia e plante as bactérias em cinco mililitros de LB com ampicilina durante a noite, sacudindo vigorosamente o tubo em uma incubadora Celsius de 37 graus. No dia seguinte, adicione dois mililitros de bactérias a 200 mililitros de LB com ampicillina em um frasco de dois litros, sacudindo vigorosamente o frasco durante a noite em uma incubadora Celsius de 37 graus. Gire a bactéria a 3.724 vezes g por 20 minutos e prossiga para a purificação do DNA.
Para criar o lentivírus contendo dCas9, primeiro cubra pratos de cultura de tecido de 100 mililitros com cinco mililitros de 0,01% Poly-L-Lysine e placa de cinco milhões de células HEK293T por prato em 10 mililitros de completo Dulbecco's Modified Eagles Medium, em seguida, prepare amostras de transfecção de DNA misturando 10 microgramas de um vetor de RNA guia contendo LTR ou um vetor Cas9 desativado contendo LTR com plasmídeos contendo componentes de vírus. Adicione água a um volume total de 450 microliters e filtre a mistura através de uma ponta de filtro de 0,2 mícrons presa a uma seringa. Em seguida, adicione 50 microlitadores de 2,5-molar de cálcio dichlorida a cada amostra de transfecção do DNA e misture suavemente.
Filtre a mistura cálcio-DNA através de uma ponta de filtro de 0,2 mícrons presa a uma seringa. Pipeta 500 microliters de 2X HBS em um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Adicione 500 microliters da mistura cálcio-DNA dropwise e suavemente vórtice.
Incubar em temperatura ambiente por três minutos. Adicione um mililitro da suspensão HBS dna-cálcio a cada prato de cultura de tecido contendo HEK293T e incuba-os em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius durante a noite. No terceiro dia, retire lentamente e descarte a mídia dos pratos.
Lave cuidadosamente as células com PBS uma vez. Adicione seis mililitros de DMEM completo suplementado com HEPES de 20 mililitros e butara de sódio de 10 mililitros. Em seguida, incubar as células em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por cinco a seis horas.
Após a incubação, lave as células com PBS uma vez e adicione cinco mililitros de DMEM completos com HEPES de 20 milimões às células HEK293T. Incubar as células em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por 12 horas. No quarto dia, colete os supernacantes celulares HEK293T e filtre o supernante contendo o vírus.
Para iniciar a contagem de partículas virais, primeiro diluir o concentrado de lavagem do kit P24 ELISA adicionando 19 partes de água destilada e desionizada. Em seguida, diluir o controle positivo deste kit para 200 nanogramas por mililitro usando RPMI 1640 como diluente e fazer diluições para uma curva padrão em tubos de 1,5 mililitro de acordo com a tabela de diluição P24 ELISA. Para medir a concentração do vírus dentro das amostras adicione as diluições amostrais aos poços designados de uma placa de 96 poços, a partir de 1:1000 diluição e modifique o volume conforme necessário, a fim de estar dentro do intervalo da curva padrão.
Em seguida, diluir as amostras com Triton X-100 para uma concentração final de 0,5% e adicionar 200 microliters de cada amostra e RPMI 1640 aos poços designados. Sele a placa e incuba-a a 37 graus Celsius por duas horas. Lave a placa com 300 microliters por poço do tampão de lavagem 1X seis vezes.
Remova qualquer excesso de fluido invertendo a placa e batendo-a em uma toalha de papel. Em seguida, adicione 100 microliters de anticorpo detector do kit a todos os poços, exceto o substrato em branco. Sele a placa e incuba-a a 37 graus Celsius por uma hora.
Lave a placa e, em seguida, remova qualquer excesso de fluido invertendo a placa e batendo-a em uma toalha de papel. Para medir o anticorpo detector, dilui o peroxidase de rabanete streptavidin à 1:100 diluição com diluente SA-HRP. Misture bem o SA-HRP diluído e adicione 100 microliters a todos os poços, exceto o em branco.
Lacre e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, lave a placa com o tampão de lavagem 1X e bata fora qualquer excesso de líquido. Solte um comprimido de orto-fenilediamina em 11 mililitros do diluente do substrato para fazer solução de substrato suficiente para uma placa.
Vórtice a solução OPD vigorosamente para dissolvê-lo completamente e protegê-lo da luz. Adicione 100 microliters de solução de substrato OPD a todos os poços, incluindo o em branco. Usando um espectrofotômetro, leia a absorvência em 450 nanômetros imediatamente.
Repita 10 vezes em intervalos de um segundo e faça a medição média. Resuspend e cultura Jurkat T-cells em um frasco T75 com uma densidade de um milhão de células em cinco mililitros da mídia de soro reduzido com polibrene. Em seguida, adicione a mídia hek293T condicionada contendo um milhão de partículas virais contendo dCas9.
Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Três dias após a infecção, gire as células a 233 vezes g por cinco minutos e resuspensá-las em 10 mililitros de DMEM completo suplementado com puramicina. Cultue as células em frascos T75 e incuba-as a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
A cada três dias por um período de nove dias, gire as células a 233 vezes g por cinco minutos e substitua a mídia pelo DMEM completo complementado com puromicina. Conte as células usando um hemócito ou um contador automatizado de células. Em seguida, em uma placa de 96 poços com tecido tratado com cultura tecidual, adicione 10.000 células em 100 microliters do DMEM completo suplementado com puromicina no primeiro poço.
Faça diluições seriais 1:1 do conteúdo dos seguintes poços com o DMEM completo complementado com puromicina. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Expanda as células clonais em duas placas de 24 poços, em seguida, placa dois milhões de células por poço de uma placa de seis poços para três dos clones.
Aplaque os outros três poços com células jurkat não transduzidas como controles. Finalmente, coloque as células em um frasco T75 e coloque as células em uma incubadora de cultura celular durante a noite. Para iniciar o PCR quantitativo para medir a expressão genética, primeiro síntese de DNA complementar adicionando um micrograma de RNA, quatro microliters de tampão de síntese de CDNA, e um microliter de transcriptase reversa a 250 tubos microliteres, em seguida, adicionar água a um volume final de 20 microlitres.
Em seguida, use um cicloviário térmico a 42 graus Celsius por 30 minutos e a 95 graus Celsius por cinco minutos para inativar a transcriptase reversa. Diluir o cDNA com 60 microlitres de água após a síntese. Execute reações em cadeia de polimerase para tubos contendo 0,5 microliters de cada primer dianteiro e reverso na concentração final de 10 micromolar, cinco microliters de verde SYBR e quatro microliters de cDNA.
Por fim, selecione células Jurkat-dCas9 em DMEM suplementadas com Hygromicina B por 10 dias. Gire as células e mude a mídia a cada três dias. Purifique RNAse e prossiga para RT-qPCR.
Neste estudo, sequências de gRNA que estavam dentro de 10 a 100 pares base longe do local de início transcricional foram utilizadas para direcionar o complexo de ativação Cas9 para o lócus transcricional de IFNG-AS1, um RNA de longo não codificação associado à doença inflamatória intestinal. Para permitir a seleção de células transduzidas duplas, um sistema de dois plasmídeos foi usado para transduzir os intensificadores dCas9 ou gRNAse para as células. Aqui as proteínas MS2 aumentam a superexpressão do IFNG-AS1.
A expressão cas9 foi confirmada para ambos os clones. Primers contra HPRT1 foram usados para confirmar a presença de RNA nas células não transduzidas. a expressão mRNA foi confirmada omitindo a transcriptase reversa da reação cDNA.
Três variantes de emendas de IFNG-AS1 podem ser detectadas com conjuntos de primer específicos de transcrição ou um primer definido contra todas as transcrições IFNG-AS1 conhecidas. Todas as curvas de fluorescência foram exponenciais com o gene de limpeza HPRT1 atingindo a fase exponencial dentro de meio ciclo entre o controle e as células expressas por gRNA IFNG-AS1. Os primers contra todas as transcrições ifng-AS1 conhecidas foram os mais detectáveis entre os experimentos, com medições de aumentos de 20 vezes na expressão IFNG-AS1.
No entanto, a terceira transcrição do IFNG-AS1 mostrou um aumento significativo de cinco a dez vezes nos níveis ifng-AS1. Para expressar ativamente o gene desejado, o design do RNA guia na etapa 2.1 é fundamental para o sucesso do protocolo. Além disso, a produção de partículas virais de qualidade garantirá uma expressão robusta de seus componentes de protocolo.
Uma vez que o gene desejado seja superexpresso, estudos funcionais podem ser realizados para investigar os mecanismos genéticos. Em nosso exemplo, optamos por olhar para a produção de citocinas após a superexpressão do nosso gene de interesse. Esta técnica foi inicialmente desenvolvida pelo Grupo Griesbach em 2013 e foi amplamente aplicada e elaborada por outros grupos.
Estávamos entusiasmados em aplicar essa técnica a RNAs há muito não codificados, a fim de explorar suas funções específicas. Lentivírus defeituosos em replicação devem ser tratados em um laboratório que foi aprovado para trabalho viral. Além disso, as linhas celulares humanas e as bactérias E.coli são consideradas biohazardous.
Por fim, plasmídeos de DNA recombinante devem ser manipulados por equipes treinadas.
