Nesta revisão, discutiremos tanto técnicas de imagem quanto bioquímicas utilizadas para estudar posicionamento e composição de organelas, bem como rearranjos de citoesqueleto observados durante a formação de uma sinapse imunológica. Os estágios iniciais de remodelação ativa permitem que as células B aumentem sua superfície celular e maximizem a quantidade de complexos de antígeno BCR reunidos na sinapse. Por outro lado, o recrutamento local de licomentosomos, juntamente com o centro na membrana sináptica, pode ser acoplado à secreção líssótimo, que é conhecida por facilitar a extração de antígenos imobilizados.
O antígeno retomado é ainda mais processado dentro de compartimentos endolíssomos em peptídeos, que são carregados em moléculas mhc classe II para apresentação às células auxiliares T. Portanto, estudar a dinâmica organela associada à sinapse imunológica é crucial para entender como as células B são totalmente ativadas. A imunofluorescência de células B ativadas com antígenos imobilizados nos permite seguir diferentes componentes celulares e como eles podem ser recrutados para a sinapse imunológica.
As células B podem ser ativadas através de antígenos imobilizados em uma superfície de contas ou uma superfície de deslizamento de tampa. As contas revestidas de antígeno são preparadas incubando ligantes específicos com amino-contas previamente tratadas com glutaraldeído para ativar grupos de amino. Resuspend contas ativadas em 100 microliters de PBS e vórtice.
Enquanto isso, prepare a solução de antígeno adicionando 100 microgramas por mL de ligante BCR em 150 microliters de PBS. Em seguida, adicione 50 microliters de contas ativadas à solução de antígeno e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lembre-se, também use um ligante não relacionado como controle negativo.
Após a incubação, lave as contas com PBS. Aspire o supernaste e substitua por PBS. Repita três vezes.
Em seguida, bloqueie os três grupos de amino por contas resuspended em 500 microliters de uma solução de BSA. Finalmente, resuspend contas em 70 microliters de PBS. Para calcular a concentração final, você pode usar um hemótmetro para contar as contas.
Para ativação de células B, use um tubo de 50 mL e células resuspendadas para uma concentração de 1,5 milhão por mL em CLICK suplementado com soro bovino fetal de 5%. Em seguida, adicione 150.000 células B, correspondendo a 100 microliters da mistura de contas celulares a uma camada de tampa revestida de poli-L-lisina incubada a 37 graus para os diferentes pontos de tempo. Uma segunda abordagem para ativar células B é semeá-las em tampas revestidas de antígeno.
Para isso, o revestimento desliza com anti-BCR e B220 com melhora a adesão celular. Prepare a solução de antígeno adicionando anti-BRC e B220 em PBS a uma concentração final de 10 microgramas por mL e 0,5 microgramas por mL, respectivamente. Em seguida, coloque o deslizamento sobre uma tampa de 24 placas de bem coberta com filme parafilm e adicione 40 microliters de solução de antígeno.
Sele a placa e, em seguida, incubar a 4 graus durante a noite. Para iniciar a ativação em deslizamento de cobertura, primeiro lave-os com PBS e deixe-os secar por alguns minutos. Em seguida, adicione 150.000 células B e incubar a 37 graus para os diferentes pontos de tempo.
Em ambos os casos, ao ativar com contas ou slides revestidos de antígeno, recomendamos começar com o ponto de maior tempo e, em seguida, seguir para os mais curtos. Uma vez que você tenha montado o deslizamento de cobertura seca no slide do microscópio, você pode usar uma epifluorescência ou um microscópio confocal para visualizar suas amostras, dependendo dos requisitos de resolução. Concentre a amostra usando a luz transmitida.
Você deve procurar por campos onde células e contas estão interagindo em uma e uma razão. Para células B ativadas em tampas cobertas de antígeno, use o objetivo de 100x para uma melhor resolução. Para parâmetros, considere tomar uma pilha de z que cubra toda a célula.
Você pode rotular actin para delimitar os limites inferiores e superiores da célula. Para células B ativadas com contas revestidas de antígeno e rotulá-la para organelas confinadas a um ponto, primeiro delimitar duas áreas: a área celular e a área de contas. Em seguida, identifique a posição ou a organela por um ponto e obtenha suas coordenadas de localização.
Desenhe dois vetores: um entre o centro celular e a organela, e outro entre o centro celular e o centro de contas. Meça o comprimento de ambos e meça o ângulo entre os dois vetores, agora chamados de alfa. Faça uma projeção com o vetor entre o centro e o centro celular usando o guassiano de alfa e, em seguida, calcule o índice de polaridade da organela dividindo o vetor projetado, a, por b.
Assim, um índice de polaridade entre zero e um indica um fenótipo polarizado. Valores entre zero e menos um indicam um fenótipo não polarizado. Para determinar o índice de polaridade para organelas mais dispersas, como os lysosomes, você pode usar o mesmo algoritmo mencionado anteriormente, alterando as coordenadas de localização da organela para as coordenadas do centro de massa dos rótulos, neste caso, lysososomes.
Da mesma forma que a análise descrita anteriormente, um índice de polaridade entre zero e um indica um fenótipo polarizado, enquanto os valores entre zero e menos um indicam um fenótipo não polarizado. Para quantificar a quantidade de cada organela bem recrutada para a nova sinapse, você pode calcular a porcentagem da fluorescência organela na conta. Para isso, você deve delimitar a conta e a área celular, medir a respectiva intensidade de fluorescência e, em seguida, dividir a fluorescência das contas pela soma da conta e da fluorescência celular.
Você obterá a quantidade de cada organela que está em contato com a nova sinapse. Alternativamente, desenhe um retângulo oposto à conta. Use um peso correspondente a um quarto do comprimento celular, em seguida, meça a intensidade da fluorescência dentro do retângulo e divida-o pela fluorescência total.
Este algoritmo sempre obterá a porcentagem da organela que está próxima da nova sinapse, mas não necessariamente em contato direto com a interface. Para quantificar os componentes associados ao centro-ao-ano em células B em repouso e ativadas. Resumidamente, determinamos três parâmetros.
A área de células e contas, e a localização centrosorial coordena. Em seguida, definimos um círculo em torno do centro e executamos uma análise de perfil radial a partir do centro do centro, previamente definido. Uma vez que você tenha o enredo, determine o raio em que 70% da fluorescência máxima é mantida.
Use este raio para desenhar um círculo em torno do centro. Por fim, obtenha densidade de fluorescência do componente de interesse na área central e na área celular, e divida ambos os valores para obter a razão de densidade fluorescente. Para medir a distribuição de organelas na interface da sinapse imunológica, primeiro identifique a área das células B em contato com o deslizamento revestido de antígeno.
Você pode rotular actin para ajudá-lo a definir esta área. Em seguida, meça a área em contato com o escorregador, a altura e a largura da célula. A área voltada para o deslizamento de cobertura revestido de antígeno é uma medida de célula B que se espalha após a ativação da célula B.
Use os valores de altura e largura para delimitar uma área central na célula, que é separada dos limites por um quarto da altura e dos valores de largura. Geralmente, estes correspondem a aproximadamente um terço da área celular total. Finalmente, calcule o recrutamento de organelas no centro da nova sinapse, dividindo a densidade de fluorescência na área central pela densidade de fluorescência de toda a célula.
Valores positivos desse índice indicam um enriquecimento organela no centro da nova sinapse. Pelo contrário, valores negativos indicam uma distribuição periférica. Para medir a distribuição de organelas através dos z-planos de células B ativadas em tampas revestidas de antígeno, primeiro delimitar a interface sináptica e o limite superior da célula.
Em seguida, desenhe uma linha através do centro celular e recira a imagem para obter uma imagem XZ. Meça a cabeça da célula e divida a imagem em 10 frações da mesma área, da sinapse imunológica até o limite superior da célula. Meça a fluorescência em cada fração z e calcule a porcentagem de fluorescência dividindo a fluorescência em cada fração z pela fluorescência total da célula.
Por fim, plote a porcentagem de intensidade de fluorescência por fração z. A fração um e dois representam a interface sináptica. Aqui está o fluxo de trabalho ou o procedimento de isolamento central.
Use 20 milhões de células B por condição. Pré-tratamento de células com Citochalasina D e Nocodazole de acordo com o protocolo necessário para facilitar o descolamento centrista. Em seguida, observe as células reutilizando-as em 5 mL de buffer TBS.
Repita usando 1 mL de tampão tbs de 0,1x complementado com 8% de sacarose. Resuspense a pelota celular com 150 microliters de tampão de lise. Centrífuga a 10.000 g por 10 minutos a 4 graus Celsius para separar o citosol e organelas do núcleo.
Recupere cuidadosamente a célula sobrenante e coloque em cima de um tubo de 1,5 mL. Encha-o com 300 microlitres de tampão de gradiente suplementado com 60% de sacarose. Centrífuga amostras a 10.000 g por 30 minutos a 4 graus Celsius.
Esse passo de centrifugação é importante para concentrar os centrossomos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o supernatante até chegar à interface. Vórtice a amostra restante no tubo.
Prepare o gradiente de sacarose descontínua em um tubo ultracentrífuga sobrepondo 0,45 mL de 70% de sacarose, com 0,27 mL de 50% de sacarose e, em seguida, 0,27 mL de 40% de sacarose no tampão de gradiente. Coloque as amostras enriquecidas com centroso no gradiente descontínuo e calibrar o peso de cada amostra nos respectivos adaptadores. Centrifugar os tubos a 40.000 g por 1 hora a 4 graus Celsius, com aceleração mínima e sem quebra para evitar perturbação do gradiente.
Após a centrifugação, colecione cuidadosamente 12 frações com o mesmo volume. Resuspenda a amostra com buffer de carregamento e execute um SDS-PAGE. Para estudar a distribuição de organelas em células B durante a formação de uma sinapse imunológica, utilizamos células 2A1.6 B ativadas com contas revestidas de antígeno para diferentes pontos de tempo.
Como controle, as células B foram ativadas com contas contendo um ligante BCR não relacionado. Em seguida, utilizando a coloração da imunofluorescência, detectamos diferentes organelas, que alteram sua localização após ativação com antígenos imobilizados. Mostramos aqui o centro, rotulado com alfa-tubulin e aparelho golgi rotulado com Rab6a.
No gráfico, mostramos o índice de polaridade para o centro e o aparelho golgi polaridade verus cada ponto de ativação, no qual cada ponto representa uma célula. Durante a ativação, observa-se que os índices de polaridade dessas organelas atingem valores mais próximos de 1, sugerindo um aumento em seu recrutamento para o IS.Organelas que exibem uma distribuição mais dispersa, como os lysosomes, também podem ser quantificados usando um índice de polaridade. Observa-se que o índice de polaridade do lyosossom atingirá valores mais positivos após a ativação, o que resulta do recrutamento para o EI. Mostramos uma abordagem complementar para quantificar o recrutamento de um lysosome em direção à sinapse imunológica.
Usando o mesmo protocolo de ativação com contas revestidas de antígeno, o recrutamento lysosome para o EI foi calculado quantificando o rótulo de fluorescência de lyossomos recrutados para a área definida em torno da conta ou dentro da área sináptica. Podemos observar essa ativação aberta. Há um aumento de lysossosomes acoplado ao local da sinapse.
Aqui apresentamos a quantificação de actina no centro em células B ativadas com contas específicas e não específicas revestidas de antígeno. A piscina de actin é indicada com uma flecha. A quantificação de componentes associados ao centro-ao-ano, como o actin neste caso, pode ser representada por um gráfico de pontos, no qual cada ponto representa uma célula.
Após a ativação, a célula B diminui na quantidade de actin ao redor do centro. Esse passo é importante para desvincular o centro da região perinuclear para permitir sua polarização à nova sinapse. Para células B ativadas na superfície revestida de antígeno, você pode estudar a remodelagem de actin, bem como o recrutamento de organelas para a membrana sináptica.
Aqui mostramos a análise de organelas, como o aparelho golgi e o ânticulo endoplasmático, que apresentam distribuição central e periférica, respectivamente. Além disso, podemos calcular a área de disseminação das células B após diferentes pontos de tempo de ativação. Para isso, rotulamos actin para ser capaz de definir o limite de célula no plano XY.
No gráfico, você pode observar o aumento na área celular após 30 e 60 minutos de ativação. A distribuição de uma organela também pode ser calculada no plano XZ, respectivamente, para a interface sináptica. O gráfico representa a distribuição de actin em z-plane, onde os dois primeiros planos correspondem à interface sináptica.
Podemos observar que a actina se torna enriquecida nesta área após a ativação. Além da análise de imagens, a abordagem bioquímica também pode ser usada para estudar a mudança na composição centralosome após a ativação celular B. Mostramos aqui uma mancha ocidental representativa de fração de centro-contendo destacada pelo retângulo bege.
Frações centrais foram isoladas em um gradiente de sacarose descontínua e detectadas pelo nivelamento gama-tubulina. A mancha ocidental abaixo mostra actin e Arp2 em frações centrais de células B descansando, que se esgotam após a ativação. Linfócitos B sofrem alterações dinâmicas na interface da membrana, a fim de formar uma sinapse imunológica funcional.
Esse processo pode ser estudado por meio de técnicas de imagem e bioquímicas descritas aqui neste vídeo. Acreditamos que esta análise pode fornecer informações de valor sobre os mecanismos moleculares envolvidos sobre como as células B podem ser ativadas eficientemente.
