Suportada por concessões do Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society do Canadá e da Fundação Linfoma do Canadá.

Prepare Reagentes Nota: Todos os PBS contém Ca 2 + e Mg 2 + <ol><li> Reagente de detecção Adicionar 20Hm 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensão de células exigirá reagente de detecção 2 ml. </li><li> Paraformaldeído 1% (células fixas) Diluir solução stock 4% paraformaldeído em PBS à temperatura ambiente. Paraformaldeído 1mL alíquota de 1% a cada tubo FACS. Três tubos FACS são necessários para cada condição experimental (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 precisará de 9 tubos FACS) </li><li> PD150606 (inibidor da calpaína) Reconstituir PD150606 em DMSO para uma concentração final de 100mM. Proteger este reagente e todas as células tratadas com da luz para a duração do experimento. </li><li> PD98059 (MEK1 inibidor) Reconstituir PD98059 em DMSO para uma concentração final de 50mM. </li></ol> Prepare Células <ol><li> Cultivar células 32Dkit menos 5 x 10 5 a 1 x 10 6 células por ml em Opti-MEM meio suplementado com 5% de soro fetal bovino, WEHI-3 sobrenadante como fonte de IL-3 (ou qualquer outra fonte de IL-3, tais como a proteína recombinante), 0,1% 2-mercaptoetanol e antibióticos. </li><li> Coletar 12 x 10 6 células 32Dkit em três tubos de 15mL Falcon (4 x 10 6 células por tubo). </li><li> Agregar as células a 1000 RPM por 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 2 mL PBS à temperatura ambiente. </li><li> Tratar uma suspensão de células com 50 ìm PD150606. Certifique-se a amostra é protegido da luz, cobrindo o tubo Falcon com papel alumínio. Vortex brevemente, em seguida, incubar por 20-30 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Tratar da suspensão de células em segundo lugar com 20Hm PD98059. Placa de células em um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos e incubar por 2 horas a 37 ° C. </li></ol> Calpaína Ensaio em células fixas <ol><li> Enquanto as amostras são incubadas com PD150606, começa o ensaio calpaína nas amostras não tratadas. Comece por adicionar o reagente de detecção de 2 ml para cada suspensão de células. Imediatamente adicionar 1mL da suspensão de células / mistura de reagentes de detecção para os tubos previamente preparado FACS com paraformaldeído 1% (0 ponto tempo minutos). </li><li> Incubar suspensões de células com o reagente de detecção por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 mL da suspensão de células para um tubo com 1 mL FACS paraformaldeído 1%. </li><li> Continue a incubar a suspensões de células com a mistura de detecção para um adicional de 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 mL da suspensão de células para um tubo com 1 mL FACS paraformaldeído 1%. </li><li> Repita ensaio calpaína em células 32Dkit que foram tratados com inibidores. </li><li> Corrigir as células durante a noite no escuro a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, agregar as células a 1800 RPM por 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 750uL PBS. Coloque as células no gelo e manter no escuro. </li></ol> Aquisição de dados para células fixas <ol><li> Analisar as células usando um LSR II (BD Bioscience). Os filtros são definidos para o Xcyte Lightwave (UV) laser, linha de excitação 355nm e potência do laser 25mW, emissão de 405 e 450 nm para substrato e produto, respectivamente. Filtros de banda passante para substrato e produto são 405/20 e 450/50. Filtros de passe longo para substrato e produto são 405 e 450. A tensão PMT foi fixado em 350-375 para o substrato e 325-350 para o produto. </li><li> Set-up um experimento FACSDiva BD com os seguintes parâmetros: dispersão para a frente; dispersão lateral; Indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). Na planilha configurar os seguintes gráficos: dispersão frente vs lado gráfico de pontos de dispersão com um portão de células vivas (Figura 1a), Indo-1 histograma Azul, Indo-1 histograma Violet, Indo-1 Blue vs Violet Indo-1 gráfico de pontos. </li><li> Calibrar o II LSR com AlignFlow e AlignFlow mais partículas fluorescentes (Invitrogen). A tensão PMT deve ser ajustada para colocar o pico do histograma talão de fluorescência no mesmo canal antes de cada experimento. </li><li> Começar a adquirir os dados usando as células 32Dkit no ponto de tempo 0 minuto. Ajustar tensões parâmetro como necessário. Adquirir e registrar 10 mil eventos por amostra. </li><li> Repita aquisição para cada amostra, enxaguar a máquina com tampão FACS entre cada tubo. </li><li> Exportar os dados. Garantir LSR II é limpo de acordo com as diretrizes do instituto. </li></ol> Calpaína Ensaio em células vivas <ol><li> Prepare as suspensões de células como acima, sem PD150606. Trazer as amostras para o II LSR e configurar filtros e parâmetros acima. Configure a planilha como acima. Incluir um gráfico de pontos grande mostrando Indo-1 Blue vs tempo. Definir o programa para adquirir o máximo de númerosmero de eventos (sem portão stop). </li><li> Adicionar 50 ìm suspensão de células PD150606 a uma das células 32Dkit. Manter a amostra no escuro e incubar a temperatura ambiente por 20-30 minutos. </li><li> Começar a adquirir dados sobre a suspensão de células 32Dkit sem PD150606. Use uma baixa taxa de fluxo de 200-300 eventos por segundo. Após 30 segundos a 1 minuto retire o tubo da máquina. Adicionar 20Hm BOC-LM-CMAC para as células. Vortex brevemente em seguida, continuar a aquisição dos dados. </li><li> Aquisição de dados por 10-20 minutos ou até os planaltos atividade calpaína. </li><li> Repita os passos 3 e 4 com as células tratadas com 32Dkit PD150606. </li><li> Exportar os dados. Garantir LSR II é limpo de acordo com as diretrizes do instituto. </li></ol> Calpaína Assay no Complexo Populações (Mixed) Célula * Esta experiência vai identificar as células 32Dkit em uma suspensão de células colhidas de um baço mouse. <ol><li> Colheita do baço de cada rato. Lisar as células vermelhas do sangue com NH 4 Cl por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Preparar suspensões única célula em 2 mL de PBS. </li><li> Divida cada suspensão de células em dois. Tratar uma suspensão de células com 50 ìm PD150606 por 20-30 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Proceda como acima para o ensaio calpaína em células Fixo (Passos 1-6) </li><li> Aspirar o sobrenadante. Lavar as células em 500μL de PBS. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em tampão coloração 200μL com BSA 2%. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Prepare o anticorpo primário (anti-camundongo FITC CD117). O anticorpo deve ser utilizada na diluição de 1:200 na coloração buffer. Certifique-se o anticorpo é mantido no escuro. </li><li> Adicionar 200μL anticorpo primário para as células. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 400μL de PBS para aumentar o volume de citometria de fluxo. Coloque as células no gelo e manter no escuro. </li><li> Proceda conforme descrito em adquirir dados para Células Fixo. Adicionar FITC aos parâmetros e incluem um histograma para FITC na planilha. </li></ol> Análise e Resultados Representante <ol><li> Analisar os dados usando programa FlowJo (Treestar). Portão em células vivas com base no perfil de dispersão para a frente e lateral (Figura 1a). Determinar a fluorescência significa para Indo-Azul a partir do portão de células viáveis ​​(Figura 1b). </li><li> a) Para a população mista de células <ul><li> uso de fluorescência FITC em parcelas de histogramas e de ponto para identificar a população 32Dkit </li><li> Determinar a fluorescência significa para Indo-Azul da população 32Dkit </li></ul></li><li> Use Microsoft Excel para o gráfico de fluorescência média (Figura 2a). Calcule a inclinação da linha entre 5 e 10 minutos. Inclinação do gráfico como um gráfico de barras para determinar a atividade calpaína nas células (Figura 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> Figura 1a. Determinação de células vivas com base no perfil de dispersão para a frente e lateral. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> Figura 1b. Variação média de fluorescência mais de 10 minutos curso de tempo. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Figura 2a" /> Figura 2a gráfico. Representante da fluorescência média. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Figura 2b" /> Figura 2b. Calpaína atividade em células 32Dkit com inibidores.

<ol>
	<li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li><li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells.">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li><li>Leloup, L., Daury, L., Maz&#233;res, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+ERK/MAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration.">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A atividade de calpaína em células 32Dkit fixa e vivendo foi determinado neste protocolo de vídeo. Tratamento da linhagem de células com o inibidor de calpaína PD150606 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. Além disso, o tratamento com o inibidor MEK1 PD98059 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. ERK é um ativador principal de calpaína-2 3. Estes resultados sugerem que calpaína-2 é a atividade predominante nas células 32Dkit. Trabalhos em curs...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>PD150606</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.</td>
</tr>
<tr>
<td>PD98059</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LSR II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry

Calpaínas são onipresentes intracelular, cálcio-sensíveis, cisteína proteases neutras<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas desempenham um papel crucial em muitos processos fisiológicos, incluindo a sinalização, remodelação do citoesqueleto, a regulação da expressão gênica da apoptose e progressão do ciclo celular<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas tem sido implicado em muitas patologias, incluindo distrofias musculares, câncer, diabetes, doença de Alzheimer e esclerose múltipla<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaína regulamentação é complexo e incompletamente compreendida. níveis de mRNA e proteína correlacionam mal com a atividade, limitando o uso de técnicas de expressão do gene ou proteína para medir a atividade calpaína. Esta detalhes protocolo de vídeo de um ensaio de citometria de fluxo desenvolvido em nosso laboratório para medir a atividade das calpaínas em células fixas e de viver. Este método usa o substrato fluorescente BOC-LM-CMAC, que é clivada especificamente pela calpaína, para medir a atividade calpaína.<sup&gt; 2</sup&gt; Neste vídeo, calpaína atividade em fixos e células vivas 32Dkit murine leukemia, sozinho ou como parte de uma população esplenócitos é medida usando um LSRII (BD Bioscience). Células 32Dkit mostraram que têm atividade elevada em comparação com esplenócitos normal.

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Este artigo irá detalhar o protocolo para medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K visualizações.  University of Toronto. Este artigo irá detalhar o protocolo para medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo.