Nosso corpo gera de 1 a 10 bilhões de células apoptóticas todos os dias. O desembaraço eficiente dessas células ajuda na remoção de detritos celulares e na manutenção dos estoques. Este método pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação celular apoptótica e a ingestão por muitos outros tipos de células fagocíticas.
Demonstrando este procedimento será Yuxuan Zhen, um técnico sênior do meu laboratório. Para colher timócitos, depois de abrir a cavidade torácica de um rato preto C57 6 ingênuo, use fórceps finos curvos para puxar o timo. Coloque o órgão em um prato de cultura tecidual contendo 10 mililitros de RPMI 1640 Medium.
Triture todo o timo contra as extremidades foscos de dois slides de microscópio e filtre a suspensão do tecido resultante através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 milímetros. Colete os timócitos por centrífugação e resuspense a pelota em 40 mililitros. Após a contagem, centrifugar as células novamente e resuspendar até duas vezes 10 para as oito células em 20 mililitros de PBS fresco por tubo de 50 mililitros.
Rotule as células com cinco CFSE micromolar em 20 mililitros de PBS por tubo. Inverta os tubos duas a três vezes para misturar antes de incubar os timócitos por não mais do que dois minutos à temperatura ambiente protegidos da luz. No final da incubação, pare a reação com 10 mililitros de soro de cavalo inativado pelo calor e colete as células por centrifugação.
Resuspend as células rotuladas em 40 mililitros de PBS fresco para contagem e centrifugação seguido por uma lavagem adicional com 40 mililitros de médio. Após a lavagem média, resuspenja os timócitos em sete vezes 10 para as seis células por mililitro de cultura tecidual de concentração média de cultura tecidual e semear as células em um prato de cultura tecidual de 100 milímetros. Em seguida, adicione a staurosporina à cultura celular em uma concentração final de um micromolar e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido por quatro horas.
Para o isolamento do macrófago peritoneal, injete dois camundongos C57 pretos 6 camundongos intraperitonel com um mililitro de 3% de thioglycolato no dia zero antes de abrir a pele abdominal sem perturbar o peritônio no quinto dia. Para lavar a cavidade peritoneal, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 para empurrar rapidamente 10 mililitros de tampão de lavagem para dentro da cavidade antes de aspirar lentamente o tampão de lavagem para coleta em um tubo de 50 mililitros. Lave o lavado peritoneal duas vezes com PBS.
Resuspend os macrófagos peritoneais em duas vezes 10 para as seis células por mililitro de cultura tecidual concentração média. Em seguida, 500 microliters de macrófagos em cada poço de uma placa de 24 poços e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido por duas horas. No final da incubação, aspire o supernascer para remover as células flutuantes e adicionar 500 microliters de meio de cultura tecidual a cada poço.
Adicione imediatamente zero a 12 vezes 10 aos seis timócitos em 500 microliters de médio a cada poço da cultura e coloque a placa na incubadora de cultura tecidual por quatro horas. No final da incubação, lave cada poço duas vezes com PBS fresco para remover quaisquer células apoptóticas flutuantes livres seguidas de uma única lavagem com tampão de coloração. Em seguida, rotule os macrófagos ligados à placa com 200 microliters de tampão de coloração complementados com um anticorpo anti-CD11b apropriado por poço e coloque a placa em quatro graus Celsius por 20 minutos.
Neste experimento representativo, até 30% dos macrófagos peritoneais estimulados por tiaglito demonstraram um sinal positivo no canal CFSE indicando que esses fagocitos haviam ingerido células apoptóticas rotuladas por CFSE. A observação microscópica do engolfamento do macrófago das células apoptóticas é essencial para investigar a capacidade dos macrófagos de ingerir células apoptóticas à medida que macrófagos positivos CFSE se espalham no quadrante inferior direito devido a diferentes intensidades indicando que o número de células apoptóticas dentro de macrófagos individuais é diferente. Uma maior proporção de células apoptóticas para macrófagos não só aumenta o número de macrófagos ingerindo células apoptóticas, mas também aumenta a capacidade dos macrófagos de ingerir células mais apoptóticas.
Em outro conjunto de experimentos, cerca de 15% dos macrófagos tornaram-se CFSE positivos quando os tímtos apoptóticos foram adicionados à cultura macrófago por quatro horas indicando que esses macrófagos eram os macrófagos fagocíticos. Os anticorpos Mer bloqueiam a eferócitose macrófago de forma dependente de dose e o bloqueio geral pode representar cerca de 30% da eficiência da equiocistose no ambiente atual. Além disso, um recém-aprovado inibidor do receptor TAM atenua a eferocisia macrófago de forma dependente de dose até cerca de 100 concentrações de nanomolar.
Lembre-se sempre de verificar a porcentagem de células apoptóticas, pois esse número afeta diretamente a eficiência da eferocitose. Os macrófagos fagocíticos podem ser ainda mais analisados pela mancha ocidental para investigar as moléculas de sinalização reguladas pelo processo de engolfação e pela microscopia para estudar a dinâmica do engolamento.
