Trabalho no laboratório SM é apoiado por um Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

<ol>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ao monitorizar autofagia e o citoesqueleto in vitro utilizando células de cultura de tecidos, os protocolos descritos nas secções 1 e 2 pode ser aplicada a uma grande variedade de tipos de células de cultura de tecidos. Além disso, a seguir autofagia (por exemplo, Atg8 / LC3 + ve autofagossomas) e do citoesqueleto (por exemplo. Caudas, actina, gaiolas septina) dinâmica em tempo real durante a infecção por Shigella usando imagens ao vivo, as células de cultura de tecidos podem ser transitoriamente transfectadas com GFP, construções RFP- ou CFP-marcado como descrito anteriormente 7,8. Para aumentar a percentagem de células infectadas por Shigella (isto é, em geral, desejável, para análise em tempo real, uma vez que a Shigella pode invadir 5-30% de células HeLa a 100: 1. MOI), adicionar directamente 400 uL de Shigella (DO600 = 0,3 -0.6) para as células em 2 ml MEM (sedentos de soro) e aguarde pelo menos 1,5 horas após a infecção para a entrada de bactérias suficiente, escapar do fagossoma, replicação, aureconhecimento tophagy e septina enjaulamento. Alternativamente, pode-se usar a estirpe de Shigella M90T AAII que expressa a adesina AfaE e foram muito mais elevadas capacidades de invasão das células epiteliais em comparação com a estirpe 28 M90T. De notar que a tensão M90T AFAI ainda não foi testado in vivo usando zebrafish. As placas de colónias de Shigella podem ser mantidas a 4 ° C durante 2-3 dias e utilizados para várias experiências. No entanto, ao longo do tempo, as colónias de Shigella que perderam o plasmídeo de virulência pode também absorver o Vermelho do Congo e parecem ter retido a sua plasmídeo de virulência. Por este motivo, recomendamos usar stocks bacterianas frescos sempre que possível. Ao monitorar a biologia celular da infecção in vivo, os protocolos descritos nas secções 3 e 4 usam wildtype AB linha de peixe-zebra. Para monitorar Shigella interações -leukocyte, linhas de peixes-zebra transgénicos pode ser usado, por exemplo, a MPX: GFP ou lyz: DsRed para visuaisize neutrófilos 19,29,30 ou mpeg1: mCherry visualizar macrófagos 19,31. Para visualizar autofagia in vivo, a linha transgénico de peixe-zebra de GFP-Lc3 19,24 pode ser utilizado tal como descrito na secção 3.8. Para perturbar a autofagia in vivo, a dose efetiva morfolino oligonucleotídeo tem de ser avaliada experimentalmente com base na sua eficiência para inibir splicing transcrição e tradução de proteínas. É aconselhável realizar uma experiência de titulação e para confirmar o esgotamento por meio de RT-PCR (por splicing oligonucleótido morfolino) ou por SDS-PAGE (por translação oligonucleótido morfolino) 32. Isolamento de RNA a partir de embriões de peixes-zebra ou larvas podem ser realizadas utilizando extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio. Para extrair a proteína a partir de larvas de peixe-zebra (8 a 15 larvas / tubo), homogeneizar mecanicamente utilizando um pilão em 200 ul de tampão de lise (Tris 1 M, 5 M de NaCl, 0,5 M de EDTA, 0,01% de óxido de etileno octilfenol condensate, e inibidores da protease). Tubos de centrifugação a 19.000 xg, a 4 ° C durante 15 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Adicionar tampão Laemmli e a amostra é aquecida a 95 ° C durante 15 min. Os lisados ​​podem ser armazenados a -80 ° C até ser necessário, e pode ser avaliada por transferência de Western tal como descrito na secção 2.3. O peixe-zebra é um excelente modelo in vivo para a aplicação do fármaco. Análise usando oligonucleótidos morfolino pode ser complementada com medicamentos estabelecidos para manipular autofagia (por exemplo, a rapamicina e bafilomicina). Larvas não infectadas e / ou infectadas podem ser tratadas com rapamicina (1,5 uM) ou bafilomicina (80 nM) diluído em E2 e fluxo autophagic pode ser avaliada por transferência de Western como descrito em 25,33. A consequência da manipulação autofagia na evolução da infecção e a sobrevivência das larvas infectadas pode ser avaliada, tal como descrito na secção 3.5. Em adição ao estudo da célula hospedeiradeterminantes, in vitro e in vivo em protocolos podem ser aplicados para avaliar os determinantes bacterianos necessários para o reconhecimento autofagia, utilizando estirpes mutantes bacterianas que são reconhecidos por autofagia diferencialmente, por exemplo., Shigella ΔicsA (a proteína Shigella IcsA recruta N-WASP e depois Arp2 / 3 para a cauda de actina e formação de gaiola septina; na sua ausência não pode haver caudas de actina, sem gaiolas Septin) e ShigellaΔicsB (Shigella evita a resposta autofágica através da proteína efetora bacteriana ICSB, o que impede o recrutamento de autofagia máquinas para IcsA; na sua ausência Pode haver mais gaiolas Septin, mais a autofagia) 7,8. Shigella não é um agente patogénico natural de peixe-zebra e cresce de forma óptima a 37 ° C. No entanto, o trabalho tem mostrado que os factores de virulência necessários para a invasão de Shigella, escapar do vacúolo fagocítica e replicação em cyTosol podem ser expressos e são funcionais em larvas de peixe-zebra, a 28 ° C 19. 28 ° C é a temperatura mais comumente utilizada para a criação de peixe-zebra e temperatura padrão para assegurar o desenvolvimento do peixe-zebra normais 23. Surpreendentemente, os principais eventos patogénicos que conduzem a shigelose em seres humanos (isto é, a morte de células de macrófagos, invasão e multiplicação dentro das células epiteliais, disseminação célula-a-célula, a destruição inflamatória do epitélio do hospedeiro) são fielmente reproduzidas no modelo de infecção por Shigella zebrafish 19. Genes Autophagy e citoesqueleto são ubiquamente expressos e têm uma ampla gama de funções biológicas. Estudos com ratos mostraram que nocaute de autofagia essencial ou 26 genes Septin 5 são letal embrionário, e é provável que alguns destes genes, é também essencial para o desenvolvimento do peixe-zebra (embora este problema pode ser reduzido pelo facto de peixes-zebra possuem múltiplosgenes parálogas 33). Se assim for, há várias alternativas para superar este problema, incluindo (i) o uso de reagentes farmacológicos para regular a autofagia e do citoesqueleto, (ii) morpholinos pode ser ajustada para baixo, (iii) nocaute de genes pode ser concebido apenas para célula específica tipos, e / ou (iv) os genes envolvidos no reconhecimento autophagic que não são essenciais para o desenvolvimento do animal (por exemplo,., p62) pode ser alvejado. Enquanto o peixe-zebra é um sistema modelo ideal para investigar a autofagia e do citoesqueleto durante a infecção Shigella, ferramentas moleculares não existem actualmente. O campo necessário para gerar novas ferramentas e expressão específica de célula de unidade de as proteínas de interesse. Para derrubar expressão de genes autofagia / citoesqueleto, são necessárias novas sequências de morfolino, e novos métodos para a engenharia de genoma (por exemplo, TALEN, CRISPR / Cas9) pode também ser usado. No entanto, várias ferramentas anteriormente gerados para estudos em seres humanos ou de ratinhopode igualmente trabalhar para peixe-zebra. As bactérias intracelulares S. flexneri surgiu como um organismo modelo excepcional para abordar questões-chave na biologia, incluindo a capacidade das bactérias para ser reconhecido pelo sistema imunológico 1,2. A célula hospedeira emprega septinas para restringir a mobilidade de S. flexneri e orientá-las para a autofagia, um componente crítico da imunidade celular autônomo 7,8. Estas observações sugerem uma nova estrutura molecular para estudar autofagia e a sua capacidade para degradar as bactérias citosólicas. A grande questão agora é decifrar totalmente os eventos moleculares e celulares subjacentes, e para validar esses eventos analisados ​​in vitro durante a infecção bacteriana in vivo utilizando modelos animais relevantes. Para este fim, o peixe-zebra foi estabelecida como um novo hospedeiro valioso para a análise de S. infecção flexneri 19. As interacções entre as bactérias e as células hospedeiras podem ser visualizados em alta resolução, eo modelo peixe-zebra deve ser útil para a compreensão da biologia celular da infecção por Shigella in vivo. Larvas de peixe-zebra pode ser utilizado para investigar o papel da autofagia bacteriana na defesa do hospedeiro, e trabalho mostrou que a perturbação de que autofagia pode afectar adversamente a sobrevivência do hospedeiro em resposta à infecção por Shigella 19. As observações geradas a partir de estudo de Shigella, Septin enjaulamento e autofagia in vitro utilizando células de cultura de tecidos e in vivo com larvas do peixe-zebra pode proporcionar avanços fundamentais na compreensão de defesa do hospedeiro. Eles também poderiam sugerir o desenvolvimento de novas estratégias destinadas a combater doenças infecciosas. Um objetivo fundamental deste relatório é fazer sentido dos eventos moleculares e celulares analisadas in vitro (isto é, a autofagia, caudas de actina, Septin enjaulamento) durante a infecção bacteriana in vivo, no contexto de uma entorganismo ira, utilizando larvas do peixe. Se não está familiarizado com a biologia do peixe-zebra e manuseio, pode referir-se a nos protocolos de profundidade para criação de peixes-zebra adequado 23 e na análise in vivo de infecção zebrafish 19,35.

Shigella flexneri, uma bactéria invasiva enteropatogénica Gram-negativas, podem escapar de fagossomas para o citosol, e polimerizar o citoesqueleto de actina hospedeiro para evadir respostas imunes citosólicas e promover intra e intercelular movimento 1,2. Apesar do conhecimento da motilidade à base de actina 3,4 in vitro, os mecanismos que limitam a disseminação de bactérias in vivo não foram completamente definidos. Isto é crítico para uma compreensão mais completa da imunidade inata e a defesa do hospedeiro. Septinas, uma família de proteínas altamente conservadas entre metazoários, são trifosfato de guanosina (GTP) ligaï¿½o ao proteínas que se reúnem em complexos hetero-oligoméricos e formam filamentos não polares que se associam com as membranas celulares e o citoesqueleto de 5,6. Trabalhos recentes descobriram que as células do hospedeiro infectado pode impedir a mobilidade baseada Shigella actina por bactérias compartimentar direcionados para autophagy dentro &#39;gaiolas&#39; Septin, revelando o primeiro mecanismo celular que neutraliza motilidade baseado actina 7,8. Um vasto campo aberto de investigação encontra-se agora em &#39;biologia septina e infecção. Montagem Septin, induzida por uma variedade de agentes patogênicos (por exemplo, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), pode emergir como uma questão-chave na defesa do hospedeiro 5,12. A autofagia, um processo de degradação intracelular altamente conservada, é visto como um componente-chave da imunidade celular-autônoma devido à sua capacidade de fornecer bactérias citossólicas ao lisossoma 13,14. No entanto, o papel de autofagia bacteriana in vivo para restringir ou promover a replicação bacteriana permanece pouco compreendido 15,16. O peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um modelo para o estudo de vertebrados de infecções por ser opticamente acessíveisnas fases larvares quando o sistema imune inato já é funcional 17,18. Trabalhos recentes têm caracterizado a susceptibilidade de larvas do peixe para S. flexneri, um paradigma para autofagia bacteriano 15, e foi utilizado o modelo de infecção -zebrafish Shigella para estudar a manipulação de autofagia para a terapia anti-bacteriana in vivo 19. Este relatório fornece novas ferramentas e ensaios para estudar S. flexneri interacções com autofagia e o citoesqueleto. Em um primeiro passo, os protocolos para monitorar interacções autofagia-citoesqueleto são descritas usando Shigella infecção da linha de células epiteliais humanas HeLa. Para avaliar o papel das interacções autofagia-citoesqueleto no processo de infecção Shigella in vitro, os métodos para manipular autofagia e componentes do citoesqueleto (utilizando siRNA ou reagentes farmacológicos) são fornecidos. Novo trabalho mostrou que, usando Shigella infecção of larvas de peixe-zebra, ensaios semelhantes pode ser aplicado para estudar a biologia celular de infecção in vivo. Protocolos para preparar e infectar larvas do peixe são detalhados, e para avaliar a resposta do hospedeiro à infecção Shigella in vivo, os protocolos para determinar a sobrevivência do hospedeiro e carga bacteriana de larvas infectadas são fornecidos. Métodos para monitorizar o recrutamento de marcadores Septin e autofagia a Shigella (utilizando larvas de peixe-zebra vivos ou fixo) e métodos para testar o papel de tais processos in vivo [usando oligonucleótidos morfolino (injectados em embriões de fase de células 1-4) ou reagentes farmacológicos ( adicionado directamente à água do banho de peixe-zebra)] também são discutidos. Este programa de trabalho é esperado para fornecer insights sobre os mecanismos necessários para o controlo da infecção por respostas do hospedeiro citosólicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Shigella flexneri é um patógeno intracelular que pode escapar de phagosomes para chegar ao citosol, e polimerizar o anfitrião do citoesqueleto de actina para promover a sua mobilidade e divulgação. Novo trabalho mostrou que as proteínas envolvidas na motilidade de actina também estão ligados a autofagia, um processo de degradação intracelular crucial para a imunidade autônoma celular. Surpreendentemente, as células hospedeiras podem impedir a motilidade à base de actina de S. flexneri por compartimentar bactérias dentro &#39;gaiolas Septin&#39; e orientando-as para a autofagia. Estas observações indicam que uma compreensão mais completa de septinas, uma família de proteínas de ligação a GTP filamentosos, irá fornecer novos insights sobre o processo de autofagia. Este relatório descreve os protocolos para monitorar as interações autofagia-citoesqueleto causadas por S. flexneri in vitro utilizando células de cultura de tecidos e em vivo, utilizando larvas de peixes-zebra. Estes protocolos permitem a investigação de mechanis intracelularesms que controlam a disseminação de bactérias no organismo nível molecular, celular e inteiro.

Após a infecção de células de cultura de tecidos in vitro, S. flexneri pode escapar do fagossoma e invadem o citosol. No citosol, as células hospedeiras podem impedir a motilidade à base de actina de Shigella por compartimentar bactérias dentro das gaiolas Septin (Figura 1A). As bactérias aprisionadas por gaiolas Septin também podem ser marcadas por marcadores autofagia p62 (Figura 1B) e LC3 (Figura 1C). Estas observações destacar um novo mecanismo de defesa do hospedeiro que restringe a disseminação de patógenos invasores, e também revelam novas ligações entre autofagia e do citoesqueleto. Surpreendentemente, a depleção de marcadores autofagia reduz significativamente septina encarceramento de bactérias (Figura 2A), e também o trabalho mostrou que a depleção de septina encarceramento reduz significativamente o recrutamento de marcadores autofagia 8. Deste modo, pelo menos no caso de Shigella, Septin conjunto de gaiola e Formações autofagossomon pode ser vista como processos interdependentes. Outros requisitos para celulares compartimentalização de Shigella por gaiolas Septin incluem a polimerização de actina e atividade actomiosina (Figura 2B). Não existe um modelo natural, rato de shigelose, e investigação de Shigella patogênese, biologia septina e autofagia bacteriana in vivo pode se beneficiar de um novo modelo animal de infecção, as larvas de peixe-zebra 19. É possível infectar larvas do peixe por bactérias de diversos sítios anatômicos, como injetar injeções intravenosas caudais para experiências de sobrevivência, e injeções musculares da cauda para a microscopia in vivo (Figura 3A). Dependendo da dose, S. flexneri injetado em larvas do peixe ou podem ser apagados dentro de 48 horas após a infecção, ou pode resultar em uma infecção progressiva e fatal, em última análise (Figuras 3B - 3D). Shigella virulência factors são expressos a 28 ° C, a temperatura óptima de crescimento do peixe-zebra, e infecção por Shigella peixe-zebra é estritamente dependente do seu sistema de secreção de tipo III (T3SS) 19, um elemento determinante de virulência em doença humana. Tomados em conjunto, estas observações indicam que a larva do peixe-zebra representa um novo hospedeiro valioso para a análise in vivo da infecção por Shigella. A acessibilidade óptico de larvas do peixe permite a visualização de enjaulamento septina in vivo (Figura 4A), um feito que nunca foi realizado usando modelos hospedeiras de mamíferos. Para complementar a evidência que as gaiolas Septin reter bactérias visadas para autofagia in vivo, pode-se infectar larvas de peixes-zebra transgénicos que expressam a GFP-Lc3 e observar recrutamento marcador autofagia a Shigella (Figura 4B). Para a análise ultraestruturais de autofagossomas Shigella in vivo, elmicroscopia ectron pode ser utilizado para mostrar claramente o sequestro citosólica de bactérias por vacúolos de dupla membrana 19. A autofagia é visto como um componente-chave da imunidade celular-autônomo e um mecanismo crucial de defesa contra bactérias intracytosolic 14-16. Para caracterizar a função autofagia in vivo, p62-morfolino tratadas larvas de peixe-zebra pode ser utilizado. Ao contrário das máquinas núcleo autofagia [ex., As proteínas 36 autofagia relacionado (ATG) 26], p62 não é essencial para o desenvolvimento dos vertebrados 27 e larvas de peixe-zebra, assim, pode desenvolver-se normalmente antes da infecção. Surpreendentemente, larvas empobrecido-p62 inoculadas com S. flexneri resultado num aumento significativo da mortalidade e uma maior carga bacteriana 19. De acordo com o trabalho in vitro mostrando que conjunto de gaiola septina é interdependente com formação autofagossomo 7,8, recrutamento septina a Shigella é claramente reduzido em larvas depleção de p62 ( <strong&gt; Figura 4C). Estes dados demonstram que a sobrevivência de peixe-zebra depende autofagia mediada por p62 para controlar a infecção bacteriana intracelular. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 A gaiola septina in vitro. (A) células HeLa foram infectadas com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, marcadas com anticorpos para SEPT9 e faloidina, e visualizados por microscopia confocal. A barra de escala, 1 um. (B) As células HeLa foram infectadas com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, marcadas com anticorpos para p62 e SEPT2, e visualizados por microscopia de luz fluorescente. A barra de escala, 1 um. Células (C) HeLa foram transfectadas com GFP-Atg8 / LC3, infectado com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, marcadas com anticorpos para SEPT2, e visualizados por mi fluorescentescroscopy. A barra de escala, 1 um. Estes números foram modificados a partir Mostowy et al 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. requisitos celulares para Shigella formação gaiola -septin. (A) células HeLa foram tratadas com controle (CTRL), p62, ATG5, ATG6 ou ATG7 siRNA. Lisados ​​de células inteiras das células tratadas com siRNA foram imunotrans para GAPDH, p62, ATG5, ATG6, ou ATG7 para mostrar a eficiência do esgotamento siRNA (superior). células tratadas com siRNA foram infectados com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, e rotuladas para microscopia quantitativa. Gráficos (em baixo) representam a média ± SEM% de Shigella em gaiolas SEPT2 de n ≥3 experiências por tratamento. (B) células HeLa foram infectadas com S. flexneri, tratado com DMSO, citocalasina D (CYTD), latrunculin B (LATB), nocodazole (Noco), ou blebbistatin (Bleb) e após 4 h 40 min foram fixados e rotulado para microscopia quantitativa. Os gráficos representam a média ± SEM% de Shigella em gaiolas SEPT2 de dois experimentos independentes por tratamento. Estes números foram modificados a partir Mostowy et al 7. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 O modelo de infecção por Shigella peixe-zebra. (A) Imagens para ilustrar orientação da larva do peixe-zebra, ao microscópio estereoscópico. (Painel esquerdo) Zebrafish larvas 72 horas pós fertilização foram posicionados lateralmente na placa de injeção com seu lado dorsal voltada para a agulha de injeção. Infecção (painel do meio) foi realizada por meio da corrente sanguínea injecting as bactérias (solução vermelho) na veia caudal, posterior à abertura urogenital. (Painel direito) Infecção no músculo da cauda foi realizada através da injeção de bactérias (solução vermelha) ao longo de um somito. (B) As curvas de sobrevida de 72 horas após a fertilização larvas injetadas com várias doses de S. flexneri e incubados a 28 ° C durante 48 horas após a infecção. O inoculo foi classificada como eficaz baixo (&lt;10 3 CFU, círculos abertos), médio (~ 4 x 10 3 CFU, triângulos abertos) ou alta (~ 10 4 UFC, quadrados abertos). A média de% ± SEM (barras horizontais) de n ≥3 experimentos por turma inóculo. (C) enumeração de bactérias vivas em homogeneizados de larvas indivíduo em vários momentos após a infecção medido por plaqueamento em LB. Note, apenas larvas depois de ter sobrevivido a infecção estão incluídos na análise enumeração. A média ± SEM (barras horizontais) também mostrado. (D) Distribuição de GFP Shigella determinada pelaimagens ao vivo usando um microscópio estereoscópico fluorescente em vários momentos após a infecção usando um, média ou inóculo alta dose baixa (caudais injeções intravenosas). Sobreposição de imagem de transmissão (cinza) e fluorescência da GFP (verde) (B) de -. (D) Estes valores foram modificados a partir Mostowy et al 19. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4.-se a biologia celular de Shigella infecção in vivo. (A) de larvas de peixe-zebra foram infectados no músculo da cauda com GFP Shigella (dose baixa), durante 24 h, fixadas, marcadas com anticorpos contra SEPT7 (vermelho) e a GFP (green ), e fotografada por microscopia confocal. Barra de escala, 5 um. (B) GFP-Lc3 larvas de peixe-zebra foram infectadas com mCherry- Shigella (dose média) para4 horas, fixado, marcadas com anticorpos contra mCherry (vermelho) e a GFP (verde), e visualizada por microscopia confocal. . Barra de escala, de 1,5 um (C) larvas do peixe tratado com controle (CTRL; imagem à esquerda) ou p62 (imagem à direita) morpholinos foram infectados com GFP Shigella, durante 4 horas (dose média), fixo, marcadas com anticorpos contra SEPT7 ( vermelho) e a GFP (verde), e visualizada por microscopia confocal. Setas destacar alguns exemplos de Shigella aprisionados em gaiolas Septin (Ctrl) ou não (p62 empobrecido) uma infecção 4 horas post. Barra de escala, 5 um. Estes números foram modificados a partir Mostowy et al 19.

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Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Para combater a disseminação da bactéria, as células hospedeiras reorganizar seu citoesqueleto de compartimentar as bactérias e induzir a autofagia. Usando Shigella infecção de células de cultura de tecidos, hospedeiro e determinantes de agentes patogénicos subjacentes a este processo são identificados e caracterizados. Utilizando modelos de peixe-zebra de infecção Shigella, o papel de moléculas e de mecanismos descobertos são investigados in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

15.7K visualizações.  Imperial College London.  Para combater a disseminação da bactéria, as células hospedeiras reorganizar seu citoesqueleto de compartimentar as bactérias e induzir a autofagia. Usando Shigella infecção de células de cultura de tecidos, hospedeiro e determinantes de agentes patogénicos subjacentes a este processo são identificados e caracterizados. Utilizando modelos de peixe-zebra de infecção Shigella, o papel de moléculas e de mecanismos descobertos são investigados...