Trabalho no laboratório SM é apoiado por um Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

<ol>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ao monitorizar autofagia e o citoesqueleto in vitro utilizando células de cultura de tecidos, os protocolos descritos nas secções 1 e 2 pode ser aplicada a uma grande variedade de tipos de células de cultura de tecidos. Além disso, a seguir autofagia (por exemplo, Atg8 / LC3 + ve autofagossomas) e do citoesqueleto (por exemplo. Caudas, actina, gaiolas septina) dinâmica em tempo real durante a infecção por Shigella usando imagens ao vivo, as células de cultura de tecidos podem ser transitoriamente transfectadas com GFP, construções RFP- ou CFP-marcado como descrito anteriormente 7,8. Para aumentar a percentagem de células infectadas por Shigella (isto é, em geral, desejável, para análise em tempo real, uma vez que a Shigella pode invadir 5-30% de células HeLa a 100: 1. MOI), adicionar directamente 400 uL de Shigella (DO600 = 0,3 -0.6) para as células em 2 ml MEM (sedentos de soro) e aguarde pelo menos 1,5 horas após a infecção para a entrada de bactérias suficiente, escapar do fagossoma, replicação, aureconhecimento tophagy e septina enjaulamento. Alternativamente, pode-se usar a estirpe de Shigella M90T AAII que expressa a adesina AfaE e foram muito mais elevadas capacidades de invasão das células epiteliais em comparação com a estirpe 28 M90T. De notar que a tensão M90T AFAI ainda não foi testado in vivo usando zebrafish. As placas de colónias de Shigella podem ser mantidas a 4 ° C durante 2-3 dias e utilizados para várias experiências. No entanto, ao longo do tempo, as colónias de Shigella que perderam o plasmídeo de virulência pode também absorver o Vermelho do Congo e parecem ter retido a sua plasmídeo de virulência. Por este motivo, recomendamos usar stocks bacterianas frescos sempre que possível. Ao monitorar a biologia celular da infecção in vivo, os protocolos descritos nas secções 3 e 4 usam wildtype AB linha de peixe-zebra. Para monitorar Shigella interações -leukocyte, linhas de peixes-zebra transgénicos pode ser usado, por exemplo, a MPX: GFP ou lyz: DsRed para visuaisize neutrófilos 19,29,30 ou mpeg1: mCherry visualizar macrófagos 19,31. Para visualizar autofagia in vivo, a linha transgénico de peixe-zebra de GFP-Lc3 19,24 pode ser utilizado tal como descrito na secção 3.8. Para perturbar a autofagia in vivo, a dose efetiva morfolino oligonucleotídeo tem de ser avaliada experimentalmente com base na sua eficiência para inibir splicing transcrição e tradução de proteínas. É aconselhável realizar uma experiência de titulação e para confirmar o esgotamento por meio de RT-PCR (por splicing oligonucleótido morfolino) ou por SDS-PAGE (por translação oligonucleótido morfolino) 32. Isolamento de RNA a partir de embriões de peixes-zebra ou larvas podem ser realizadas utilizando extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio. Para extrair a proteína a partir de larvas de peixe-zebra (8 a 15 larvas / tubo), homogeneizar mecanicamente utilizando um pilão em 200 ul de tampão de lise (Tris 1 M, 5 M de NaCl, 0,5 M de EDTA, 0,01% de óxido de etileno octilfenol condensate, e inibidores da protease). Tubos de centrifugação a 19.000 xg, a 4 ° C durante 15 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Adicionar tampão Laemmli e a amostra é aquecida a 95 ° C durante 15 min. Os lisados ​​podem ser armazenados a -80 ° C até ser necessário, e pode ser avaliada por transferência de Western tal como descrito na secção 2.3. O peixe-zebra é um excelente modelo in vivo para a aplicação do fármaco. Análise usando oligonucleótidos morfolino pode ser complementada com medicamentos estabelecidos para manipular autofagia (por exemplo, a rapamicina e bafilomicina). Larvas não infectadas e / ou infectadas podem ser tratadas com rapamicina (1,5 uM) ou bafilomicina (80 nM) diluído em E2 e fluxo autophagic pode ser avaliada por transferência de Western como descrito em 25,33. A consequência da manipulação autofagia na evolução da infecção e a sobrevivência das larvas infectadas pode ser avaliada, tal como descrito na secção 3.5. Em adição ao estudo da célula hospedeiradeterminantes, in vitro e in vivo em protocolos podem ser aplicados para avaliar os determinantes bacterianos necessários para o reconhecimento autofagia, utilizando estirpes mutantes bacterianas que são reconhecidos por autofagia diferencialmente, por exemplo., Shigella ΔicsA (a proteína Shigella IcsA recruta N-WASP e depois Arp2 / 3 para a cauda de actina e formação de gaiola septina; na sua ausência não pode haver caudas de actina, sem gaiolas Septin) e ShigellaΔicsB (Shigella evita a resposta autofágica através da proteína efetora bacteriana ICSB, o que impede o recrutamento de autofagia máquinas para IcsA; na sua ausência Pode haver mais gaiolas Septin, mais a autofagia) 7,8. Shigella não é um agente patogénico natural de peixe-zebra e cresce de forma óptima a 37 ° C. No entanto, o trabalho tem mostrado que os factores de virulência necessários para a invasão de Shigella, escapar do vacúolo fagocítica e replicação em cyTosol podem ser expressos e são funcionais em larvas de peixe-zebra, a 28 ° C 19. 28 ° C é a temperatura mais comumente utilizada para a criação de peixe-zebra e temperatura padrão para assegurar o desenvolvimento do peixe-zebra normais 23. Surpreendentemente, os principais eventos patogénicos que conduzem a shigelose em seres humanos (isto é, a morte de células de macrófagos, invasão e multiplicação dentro das células epiteliais, disseminação célula-a-célula, a destruição inflamatória do epitélio do hospedeiro) são fielmente reproduzidas no modelo de infecção por Shigella zebrafish 19. Genes Autophagy e citoesqueleto são ubiquamente expressos e têm uma ampla gama de funções biológicas. Estudos com ratos mostraram que nocaute de autofagia essencial ou 26 genes Septin 5 são letal embrionário, e é provável que alguns destes genes, é também essencial para o desenvolvimento do peixe-zebra (embora este problema pode ser reduzido pelo facto de peixes-zebra possuem múltiplosgenes parálogas 33). Se assim for, há várias alternativas para superar este problema, incluindo (i) o uso de reagentes farmacológicos para regular a autofagia e do citoesqueleto, (ii) morpholinos pode ser ajustada para baixo, (iii) nocaute de genes pode ser concebido apenas para célula específica tipos, e / ou (iv) os genes envolvidos no reconhecimento autophagic que não são essenciais para o desenvolvimento do animal (por exemplo,., p62) pode ser alvejado. Enquanto o peixe-zebra é um sistema modelo ideal para investigar a autofagia e do citoesqueleto durante a infecção Shigella, ferramentas moleculares não existem actualmente. O campo necessário para gerar novas ferramentas e expressão específica de célula de unidade de as proteínas de interesse. Para derrubar expressão de genes autofagia / citoesqueleto, são necessárias novas sequências de morfolino, e novos métodos para a engenharia de genoma (por exemplo, TALEN, CRISPR / Cas9) pode também ser usado. No entanto, várias ferramentas anteriormente gerados para estudos em seres humanos ou de ratinhopode igualmente trabalhar para peixe-zebra. As bactérias intracelulares S. flexneri surgiu como um organismo modelo excepcional para abordar questões-chave na biologia, incluindo a capacidade das bactérias para ser reconhecido pelo sistema imunológico 1,2. A célula hospedeira emprega septinas para restringir a mobilidade de S. flexneri e orientá-las para a autofagia, um componente crítico da imunidade celular autônomo 7,8. Estas observações sugerem uma nova estrutura molecular para estudar autofagia e a sua capacidade para degradar as bactérias citosólicas. A grande questão agora é decifrar totalmente os eventos moleculares e celulares subjacentes, e para validar esses eventos analisados ​​in vitro durante a infecção bacteriana in vivo utilizando modelos animais relevantes. Para este fim, o peixe-zebra foi estabelecida como um novo hospedeiro valioso para a análise de S. infecção flexneri 19. As interacções entre as bactérias e as células hospedeiras podem ser visualizados em alta resolução, eo modelo peixe-zebra deve ser útil para a compreensão da biologia celular da infecção por Shigella in vivo. Larvas de peixe-zebra pode ser utilizado para investigar o papel da autofagia bacteriana na defesa do hospedeiro, e trabalho mostrou que a perturbação de que autofagia pode afectar adversamente a sobrevivência do hospedeiro em resposta à infecção por Shigella 19. As observações geradas a partir de estudo de Shigella, Septin enjaulamento e autofagia in vitro utilizando células de cultura de tecidos e in vivo com larvas do peixe-zebra pode proporcionar avanços fundamentais na compreensão de defesa do hospedeiro. Eles também poderiam sugerir o desenvolvimento de novas estratégias destinadas a combater doenças infecciosas. Um objetivo fundamental deste relatório é fazer sentido dos eventos moleculares e celulares analisadas in vitro (isto é, a autofagia, caudas de actina, Septin enjaulamento) durante a infecção bacteriana in vivo, no contexto de uma entorganismo ira, utilizando larvas do peixe. Se não está familiarizado com a biologia do peixe-zebra e manuseio, pode referir-se a nos protocolos de profundidade para criação de peixes-zebra adequado 23 e na análise in vivo de infecção zebrafish 19,35.

Shigella flexneri, uma bactéria invasiva enteropatogénica Gram-negativas, podem escapar de fagossomas para o citosol, e polimerizar o citoesqueleto de actina hospedeiro para evadir respostas imunes citosólicas e promover intra e intercelular movimento 1,2. Apesar do conhecimento da motilidade à base de actina 3,4 in vitro, os mecanismos que limitam a disseminação de bactérias in vivo não foram completamente definidos. Isto é crítico para uma compreensão mais completa da imunidade inata e a defesa do hospedeiro. Septinas, uma família de proteínas altamente conservadas entre metazoários, são trifosfato de guanosina (GTP) ligaï¿½o ao proteínas que se reúnem em complexos hetero-oligoméricos e formam filamentos não polares que se associam com as membranas celulares e o citoesqueleto de 5,6. Trabalhos recentes descobriram que as células do hospedeiro infectado pode impedir a mobilidade baseada Shigella actina por bactérias compartimentar direcionados para autophagy dentro &#39;gaiolas&#39; Septin, revelando o primeiro mecanismo celular que neutraliza motilidade baseado actina 7,8. Um vasto campo aberto de investigação encontra-se agora em &#39;biologia septina e infecção. Montagem Septin, induzida por uma variedade de agentes patogênicos (por exemplo, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), pode emergir como uma questão-chave na defesa do hospedeiro 5,12. A autofagia, um processo de degradação intracelular altamente conservada, é visto como um componente-chave da imunidade celular-autônoma devido à sua capacidade de fornecer bactérias citossólicas ao lisossoma 13,14. No entanto, o papel de autofagia bacteriana in vivo para restringir ou promover a replicação bacteriana permanece pouco compreendido 15,16. O peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um modelo para o estudo de vertebrados de infecções por ser opticamente acessíveisnas fases larvares quando o sistema imune inato já é funcional 17,18. Trabalhos recentes têm caracterizado a susceptibilidade de larvas do peixe para S. flexneri, um paradigma para autofagia bacteriano 15, e foi utilizado o modelo de infecção -zebrafish Shigella para estudar a manipulação de autofagia para a terapia anti-bacteriana in vivo 19. Este relatório fornece novas ferramentas e ensaios para estudar S. flexneri interacções com autofagia e o citoesqueleto. Em um primeiro passo, os protocolos para monitorar interacções autofagia-citoesqueleto são descritas usando Shigella infecção da linha de células epiteliais humanas HeLa. Para avaliar o papel das interacções autofagia-citoesqueleto no processo de infecção Shigella in vitro, os métodos para manipular autofagia e componentes do citoesqueleto (utilizando siRNA ou reagentes farmacológicos) são fornecidos. Novo trabalho mostrou que, usando Shigella infecção of larvas de peixe-zebra, ensaios semelhantes pode ser aplicado para estudar a biologia celular de infecção in vivo. Protocolos para preparar e infectar larvas do peixe são detalhados, e para avaliar a resposta do hospedeiro à infecção Shigella in vivo, os protocolos para determinar a sobrevivência do hospedeiro e carga bacteriana de larvas infectadas são fornecidos. Métodos para monitorizar o recrutamento de marcadores Septin e autofagia a Shigella (utilizando larvas de peixe-zebra vivos ou fixo) e métodos para testar o papel de tais processos in vivo [usando oligonucleótidos morfolino (injectados em embriões de fase de células 1-4) ou reagentes farmacológicos ( adicionado directamente à água do banho de peixe-zebra)] também são discutidos. Este programa de trabalho é esperado para fornecer insights sobre os mecanismos necessários para o controlo da infecção por respostas do hospedeiro citosólicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Shigella flexneri é um patógeno intracelular que pode escapar de phagosomes para chegar ao citosol, e polimerizar o anfitrião do citoesqueleto de actina para promover a sua mobilidade e divulgação. Novo trabalho mostrou que as proteínas envolvidas na motilidade de actina também estão ligados a autofagia, um processo de degradação intracelular crucial para a imunidade autônoma celular. Surpreendentemente, as células hospedeiras podem impedir a motilidade à base de actina de S. flexneri por compartimentar bactérias dentro &#39;gaiolas Septin&#39; e orientando-as para a autofagia. Estas observações indicam que uma compreensão mais completa de septinas, uma família de proteínas de ligação a GTP filamentosos, irá fornecer novos insights sobre o processo de autofagia. Este relatório descreve os protocolos para monitorar as interações autofagia-citoesqueleto causadas por S. flexneri in vitro utilizando células de cultura de tecidos e em vivo, utilizando larvas de peixes-zebra. Estes protocolos permitem a investigação de mechanis intracelularesms que controlam a disseminação de bactérias no organismo nível molecular, celular e inteiro.

Após a infecção de células de cultura de tecidos in vitro, S. flexneri pode escapar do fagossoma e invadem o citosol. No citosol, as células hospedeiras podem impedir a motilidade à base de actina de Shigella por compartimentar bactérias dentro das gaiolas Septin (Figura 1A). As bactérias aprisionadas por gaiolas Septin também podem ser marcadas por marcadores autofagia p62 (Figura 1B) e LC3 (Figura 1C). Estas observações destacar um novo mecanismo de defesa do hospedeiro que restringe a disseminação de patógenos invasores, e também revelam novas ligações entre autofagia e do citoesqueleto. Surpreendentemente, a depleção de marcadores autofagia reduz significativamente septina encarceramento de bactérias (Figura 2A), e também o trabalho mostrou que a depleção de septina encarceramento reduz significativamente o recrutamento de marcadores autofagia 8. Deste modo, pelo menos no caso de Shigella, Septin conjunto de gaiola e Formações autofagossomon pode ser vista como processos interdependentes. Outros requisitos para celulares compartimentalização de Shigella por gaiolas Septin incluem a polimerização de actina e atividade actomiosina (Figura 2B). Não existe um modelo natural, rato de shigelose, e investigação de Shigella patogênese, biologia septina e autofagia bacteriana in vivo pode se beneficiar de um novo modelo animal de infecção, as larvas de peixe-zebra 19. É possível infectar larvas do peixe por bactérias de diversos sítios anatômicos, como injetar injeções intravenosas caudais para experiências de sobrevivência, e injeções musculares da cauda para a microscopia in vivo (Figura 3A). Dependendo da dose, S. flexneri injetado em larvas do peixe ou podem ser apagados dentro de 48 horas após a infecção, ou pode resultar em uma infecção progressiva e fatal, em última análise (Figuras 3B - 3D). Shigella virulência factors são expressos a 28 ° C, a temperatura óptima de crescimento do peixe-zebra, e infecção por Shigella peixe-zebra é estritamente dependente do seu sistema de secreção de tipo III (T3SS) 19, um elemento determinante de virulência em doença humana. Tomados em conjunto, estas observações indicam que a larva do peixe-zebra representa um novo hospedeiro valioso para a análise in vivo da infecção por Shigella. A acessibilidade óptico de larvas do peixe permite a visualização de enjaulamento septina in vivo (Figura 4A), um feito que nunca foi realizado usando modelos hospedeiras de mamíferos. Para complementar a evidência que as gaiolas Septin reter bactérias visadas para autofagia in vivo, pode-se infectar larvas de peixes-zebra transgénicos que expressam a GFP-Lc3 e observar recrutamento marcador autofagia a Shigella (Figura 4B). Para a análise ultraestruturais de autofagossomas Shigella in vivo, elmicroscopia ectron pode ser utilizado para mostrar claramente o sequestro citosólica de bactérias por vacúolos de dupla membrana 19. A autofagia é visto como um componente-chave da imunidade celular-autônomo e um mecanismo crucial de defesa contra bactérias intracytosolic 14-16. Para caracterizar a função autofagia in vivo, p62-morfolino tratadas larvas de peixe-zebra pode ser utilizado. Ao contrário das máquinas núcleo autofagia [ex., As proteínas 36 autofagia relacionado (ATG) 26], p62 não é essencial para o desenvolvimento dos vertebrados 27 e larvas de peixe-zebra, assim, pode desenvolver-se normalmente antes da infecção. Surpreendentemente, larvas empobrecido-p62 inoculadas com S. flexneri resultado num aumento significativo da mortalidade e uma maior carga bacteriana 19. De acordo com o trabalho in vitro mostrando que conjunto de gaiola septina é interdependente com formação autofagossomo 7,8, recrutamento septina a Shigella é claramente reduzido em larvas depleção de p62 ( <strong&gt; Figura 4C). Estes dados demonstram que a sobrevivência de peixe-zebra depende autofagia mediada por p62 para controlar a infecção bacteriana intracelular. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 A gaiola septina in vitro. (A) células HeLa foram infectadas com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, marcadas com anticorpos para SEPT9 e faloidina, e visualizados por microscopia confocal. A barra de escala, 1 um. (B) As células HeLa foram infectadas com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, marcadas com anticorpos para p62 e SEPT2, e visualizados por microscopia de luz fluorescente. A barra de escala, 1 um. Células (C) HeLa foram transfectadas com GFP-Atg8 / LC3, infectado com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, marcadas com anticorpos para SEPT2, e visualizados por mi fluorescentescroscopy. A barra de escala, 1 um. Estes números foram modificados a partir Mostowy et al 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. requisitos celulares para Shigella formação gaiola -septin. (A) células HeLa foram tratadas com controle (CTRL), p62, ATG5, ATG6 ou ATG7 siRNA. Lisados ​​de células inteiras das células tratadas com siRNA foram imunotrans para GAPDH, p62, ATG5, ATG6, ou ATG7 para mostrar a eficiência do esgotamento siRNA (superior). células tratadas com siRNA foram infectados com S. flexneri, durante 4 h 40 min, fixa, e rotuladas para microscopia quantitativa. Gráficos (em baixo) representam a média ± SEM% de Shigella em gaiolas SEPT2 de n ≥3 experiências por tratamento. (B) células HeLa foram infectadas com S. flexneri, tratado com DMSO, citocalasina D (CYTD), latrunculin B (LATB), nocodazole (Noco), ou blebbistatin (Bleb) e após 4 h 40 min foram fixados e rotulado para microscopia quantitativa. Os gráficos representam a média ± SEM% de Shigella em gaiolas SEPT2 de dois experimentos independentes por tratamento. Estes números foram modificados a partir Mostowy et al 7. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 O modelo de infecção por Shigella peixe-zebra. (A) Imagens para ilustrar orientação da larva do peixe-zebra, ao microscópio estereoscópico. (Painel esquerdo) Zebrafish larvas 72 horas pós fertilização foram posicionados lateralmente na placa de injeção com seu lado dorsal voltada para a agulha de injeção. Infecção (painel do meio) foi realizada por meio da corrente sanguínea injecting as bactérias (solução vermelho) na veia caudal, posterior à abertura urogenital. (Painel direito) Infecção no músculo da cauda foi realizada através da injeção de bactérias (solução vermelha) ao longo de um somito. (B) As curvas de sobrevida de 72 horas após a fertilização larvas injetadas com várias doses de S. flexneri e incubados a 28 ° C durante 48 horas após a infecção. O inoculo foi classificada como eficaz baixo (&lt;10 3 CFU, círculos abertos), médio (~ 4 x 10 3 CFU, triângulos abertos) ou alta (~ 10 4 UFC, quadrados abertos). A média de% ± SEM (barras horizontais) de n ≥3 experimentos por turma inóculo. (C) enumeração de bactérias vivas em homogeneizados de larvas indivíduo em vários momentos após a infecção medido por plaqueamento em LB. Note, apenas larvas depois de ter sobrevivido a infecção estão incluídos na análise enumeração. A média ± SEM (barras horizontais) também mostrado. (D) Distribuição de GFP Shigella determinada pelaimagens ao vivo usando um microscópio estereoscópico fluorescente em vários momentos após a infecção usando um, média ou inóculo alta dose baixa (caudais injeções intravenosas). Sobreposição de imagem de transmissão (cinza) e fluorescência da GFP (verde) (B) de -. (D) Estes valores foram modificados a partir Mostowy et al 19. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4.-se a biologia celular de Shigella infecção in vivo. (A) de larvas de peixe-zebra foram infectados no músculo da cauda com GFP Shigella (dose baixa), durante 24 h, fixadas, marcadas com anticorpos contra SEPT7 (vermelho) e a GFP (green ), e fotografada por microscopia confocal. Barra de escala, 5 um. (B) GFP-Lc3 larvas de peixe-zebra foram infectadas com mCherry- Shigella (dose média) para4 horas, fixado, marcadas com anticorpos contra mCherry (vermelho) e a GFP (verde), e visualizada por microscopia confocal. . Barra de escala, de 1,5 um (C) larvas do peixe tratado com controle (CTRL; imagem à esquerda) ou p62 (imagem à direita) morpholinos foram infectados com GFP Shigella, durante 4 horas (dose média), fixo, marcadas com anticorpos contra SEPT7 ( vermelho) e a GFP (verde), e visualizada por microscopia confocal. Setas destacar alguns exemplos de Shigella aprisionados em gaiolas Septin (Ctrl) ou não (p62 empobrecido) uma infecção 4 horas post. Barra de escala, 5 um. Estes números foram modificados a partir Mostowy et al 19.

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Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Para combater a disseminação da bactéria, as células hospedeiras reorganizar seu citoesqueleto de compartimentar as bactérias e induzir a autofagia. Usando Shigella infecção de células de cultura de tecidos, hospedeiro e determinantes de agentes patogénicos subjacentes a este processo são identificados e caracterizados. Utilizando modelos de peixe-zebra de infecção Shigella, o papel de moléculas e de mecanismos descobertos são investigados in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

15.7K visualizações.  Imperial College London.  Para combater a disseminação da bactéria, as células hospedeiras reorganizar seu citoesqueleto de compartimentar as bactérias e induzir a autofagia. Usando Shigella infecção de células de cultura de tecidos, hospedeiro e determinantes de agentes patogénicos subjacentes a este processo são identificados e caracterizados. Utilizando modelos de peixe-zebra de infecção Shigella, o papel de moléculas e de mecanismos descobertos são investigados...

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Imunologia e Infecção

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...