Este protocolo nos permite monitorar a dinâmica de interação e a resolução da junção holliday por retalho endonuclease 1 ao nível de molécula única e outros sistemas enzimáticos. Bem, alguns terão uma média em toda a população molecular ou garantem os passos mecanicistas individuais subjacentes e há. Métodos de molécula única fornecem esses detalhes monitorando o comportamento em tempo real de moléculas individuais.
Métodos de molécula única podem detectar eficientemente interações biomoleculares na faixa pico e nanomolar com alta especificidade. O que é útil para muitas soluções práticas em diagnósticos, sequenciamento de genomas e sensoriamento. Métodos ópticos e forçados de medição de moléculas únicas são amplamente aplicados em Física, Química e Biologia e são comprovados para fornecer observações nobres que são inacessíveis por outros métodos.
Meu conselho para os usuários iniciantes é acompanhar de perto os passos detalhados estabelecidos neste protocolo. As ilustrações visuais do procedimento prático deste protocolo levarão à implementação bem sucedida da técnica. Para preparar a célula de fluxo de canal único, comece perfurando dois furos de 1,22 milímetros de diâmetro na parte média de um slide de quartzo de 50 por 20 milímetros com os centros a 37 milímetros de distância e 6,5 milímetros da borda do slide.
Use um cortador eletrônico para cortar um canal de 41 por 2,25 milímetros em um pedaço de 50 por 20 milímetros de uma folha de adesivo duplo e retire o lado plástico da tampa protetora. Alinhe as bordas da peça com as bordas do slide de quartzo e use um par de pinças de politetrafluoroetileno para remover suavemente quaisquer bolhas de ar presas. Retire o lado do papel da peça adesiva e monte a peça sobre a superfície funcionalizada de um deslizamento de tampa.
Em seguida, corte um pedaço de tubo de polietileno com um diâmetro interno de 1,22 milímetros para um comprimento de 11 centímetros para a entrada e um pedaço de tubulação de 25 centímetros para a tomada. Em seguida, insira os tubos nos orifícios previamente perfurados como os tubos de entrada e saída para a célula de fluxo. E use cola epóxi de cinco minutos para selar as bordas da interface de deslizamento de tampa de quartzo nos tubos de entrada e saída.
Quando a célula secar, use uma seringa de 1 milímetro para lavar 0,2 micrômetro filtrado 0,03 miligramas por mililitro de concentração de pbs na célula usando uma segunda seringa cheia apenas com tampão para lavar qualquer excesso de avidin no final da profusão. Para realizar um experimento fret de cor única, primeiro aplique uma gota de óleo de imersão em um objetivo total de fluorescência de reflexão interna 100 vezes maior e coloque a multiplicação on chip de fotoeletrões para um ganho adequado para otimizar o sinal ao fundo e evitar a saturação. Coloque cuidadosamente a célula de fluxo no suporte da amostra e use o ajuste do curso para aumentar gradualmente o objetivo até que o óleo toque o deslizamento da tampa.
Ligue o laser de 532 nanômetros e mude para o modo de ajuste fino do objetivo. Direcione a emissão para a porta da câmera para observar a imagem no monitor e ajustar a altura do objetivo até que a superfície funcionalizada do deslizamento da tampa seja colocada em foco e possa ser observada no monitor. Verifique se o fundo da superfície funcionalizada dos deslizamentos de cobertura não excede poucos pontos antes de fluir no HJ rotulado fluorescentemente. Quando o sistema estiver pronto entre 0,2 e 0,5 microlitres do substrato diluído de interesse em 120 microliters de tampão de imagem com sistema de limpeza de oxigênio em um tubo de 0,5 mililitro e conecte a saída da célula lenta a uma bomba de seringa.
Insira o tubo de entrada no tubo de 1,5 mililitro e inicie a bomba de seringa a um microliter de 30 a 50 por minuto para retirar a solução do tubo. Frequentemente imagem a superfície brevemente com o laser verde para confirmar uma boa cobertura da célula com 100 a 300 partículas de substrato homogêneo distribuído e bem espaçado. Se a superfície da célula de fluxo estiver adequadamente coberta, lave outros 120 microliters de tampão de imagem a 30 a 50 microliters por minuto para lavar qualquer HJ não vinculado e permitir que a célula de fluxo se sente por 5 minutos para permitir que o sistema de escoamento de oxigênio despoje o oxigênio dissolvido.
Ajuste o tempo de exposição para aproximadamente 60 milissegundos. O tempo de ciclo será definido automaticamente pelo software com base na velocidade de transferência de dados. Especifique o número desejado de ciclos ou quadros para aproximadamente 400.
A emissão do doador e fluoroforos aceitores são divididas em canais de cores por um dispositivo divisor de imagens. Selecione uma área adequada na superfície, ajuste a altura do objetivo para focar a imagem e gravar e salvar o filme em formato de tiff de 16 bits. Então mude-se para uma nova área.
Lave a célula com 120 microliters de tampão de imagem complementados com as concentrações indicadas de GEN1 a uma taxa de fluxo de 30 microliters por minuto, uma concentração por vez. Na resolução do experimento de decote HJ, ajuste a taxa de fluxo para 110 microliters por minuto e inicie a gravação de 5 a 10 segundos antes da entrada da enzima na célula de fluxo. a imagem para iniciar de 5 a 10 segundos antes da entrada da enzima na célula de fluxo maximizará o número de eventos.
Quando todas as concentrações forem testadas, use um slide de contas fluorescente fixo para mapear o doador e as partículas aceitadoras umas para as outras no dispositivo de divisão de imagens. Após a instalação do pacote de software apropriado para gerar uma matriz de transformação, abra a filme de slides de contas gravada e selecione as posições das contas individuais nos canais doador e aceitador. Quando a matriz tiver sido gerada a partir do slide de contas fixa clique em Carregar TFORM e selecione o arquivo de matriz de transformação.
No menu suspenso do filtro de canal, clique na opção D&A para selecionar partículas rotuladas com o doador e o aceitor. Em seguida, digite plotTimetraceCW como instruído no manual para gerar os traços de tempo para cada molécula. Para realizar um experimento ALEX FRET, grave um filme composto de quadros consecutivos de emissões de doadores e aceitadores por excitações diretas com os lasers verde e vermelho.
Abra os filmes alex adquiridos e estabeleça o limite de detecção adequado em aproximadamente 300 para cada uma das emissões de doadores devido à excitação do doador, emissão de aceitação devido à excitação do doador e emissão de aceitação devido aos canais de excitação direta. Aplique os filtros de canal apropriados para selecionar para as partículas que foram doadoras e aceitadoras e vincular 200 a 300 partículas em cada um dos três canais. Use o código plotHistALEX MATLAB para gerar histogramas ALEX que encaixem diferentes picos nas funções do histograma e use um programa de grafia e análise adequado para determinar a porcentagem da área sob a curva para cada população.
Em seguida, use o código plotTimetraceALEX MATLAB para gerar um rastreamento de tempo para cada molécula mostrando a emissão do doador pela excitação direta nas emissões de aceitadores devido ao FRET e à excitação direta. Este histograma fret de excitação representativa do rótulo adjacente X-0 mostra dois picos que correspondem à troca dos isômeros mais abundantes e menos abundantes. As taxas de isomerização obtidas a partir dos histogramas de tempo de Dwell dos isômeros são consistentes com as relatadas anteriormente.
Os histogramas fret de molécula única da junção de rótulo adjacente X-0 em diferentes concentrações GEN1 adquiridas por ALEX, revelam um pico correspondente ao isômero fret alto livre e um pico correspondente à população hj vinculada depois de subtrair a contribuição do isômero menos abundante do pico de baixo FRET. Em uma concentração de GEN1 saturante, o histograma FRET de X-0 tem apenas um único pico fret baixo correspondente ao GEN1 ligado a qualquer isômero do HJ como previsto pelo modelo. A ligação do monômero GEN1 ao HJ seguido pela formação de dimer é uma característica única do eucariótico HJ resolvase GEN1 em comparação com resoluções procarióticas que existem em forma dimeric na solução.
Outra evidência de que o monômero GEN1 liga e distorce o HJ é a observação de um número significativo de vestígios de partículas impiedosas com um estado fret baixo estável na presença de magnésio em baixas concentrações gen1. A partida simultânea do doador e do aceitador após um estado fret baixo estável em traços de X-0 resolvido que ocorre sem o surgimento de um intermediário indica que uma resolução completa ocorre durante a vida útil do complexo GEN1 HJ. Observe que o fundo da superfície de vidro funcionalizado não deve exceder alguns pontos e que partículas distribuídas uniformemente são essenciais para obter bons resultados.
Use sempre equipamentos de proteção individual e um capuz de fumaça enquanto prepara a imagem de serialização. Certifique-se de usar óculos de proteção específicos para os comprimentos de onda ao trabalhar com lasers. Outros métodos, como crio ap, ressonância magnética nuclear, podem fornecer detalhes estruturais de nível atômico.
Essas informações são fundamentais para o desenho e interpretação dos experimentos fret de molécula única. Molécula única FRET abre novas visões no campo da replicação do DNA resultando em uma compreensão mais profunda dos mecanismos de ações helicases e nucleases.
