Nosso protocolo é significativo porque permite tanto a dereplicação econômica quanto oportuna de antibióticos conhecidos sem o uso de equipamentos especializados. A principal vantagem dessa técnica é a personalização do modelo. Isso significa que um indivíduo pode adaptar quais genes de resistência eles desejam incluir em seu modelo de biblioteca com base no nível desejado de especificidade de substrato amplo ou estreito.
Por exemplo, um modelo beta-lactam está expressando e.coli modelo pode ser preparado a fim de permitir a dereplicação altamente específica de beta-lactams e suas várias subclasses. Utilizando uma técnica séptica, pipeta 500 microliters de alcagração ajustada MHB de um reservatório estéril em cada poço de uma placa de poço estéril, 96 profunda. Com as placas de tensão ARP ou MARP preparadas, use uma vara aplicadora para inocular a placa de poço profundo 96 de acordo com o mapa ARP ou MARP.
Coloque uma membrana de vedação respirável na superfície da placa do poço profundo e incuba-a durante a noite a 37 graus Celsius, 250 RPM. Certifique-se de que não há poços contaminados. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microliters de cada poço da placa de poço profundo para uma placa inferior redonda estéril de 96 poços.
Adicione 100 microliters de 50% glicerol estéril em cada poço e misture suavemente tubos para cima e para baixo. Prepare pelo menos cinco placas da biblioteca. Cubra as placas com vedações de alumínio estéreis e certifique-se de que cada poço esteja selado individualmente.
Coloque a tampa da placa em cima do selo de alumínio e armazene a menos 80 graus Celsius. Usando uma vara aplicadora de madeira, raspe suavemente os esporos da superfície de uma colônia de estreptomoses e transfira-o para um tubo de ensaio contendo uma conta de vidro estéril e três mililitros de meio antibiótico streptomyces. Feche o tubo de ensaio livremente com uma tampa para permitir a aeração.
Usando a mesma vara de aplicador de madeira, traço um controle de esterilidade em uma placa de Petri contendo ágar bennett. Incubar o tubo contendo cultura de sementes a 30 graus Celsius com aeração por seis dias a 250 RPM e a placa de controle de esterilidade a 30 graus Celsius por seis dias. Em seguida, em uma superfície nivelada, prepare placas de desreplicação.
Aspire 23 mililitros de ágar quente bennett em uma pipeta sorológica e dispense 20 mililitros uniformemente através da superfície de uma placa de Petri retangular, deixando o restante do meio na pipeta para evitar a formação de bolhas de ar. Cubra a placa com uma tampa. Gire suavemente a placa até que o meio cubra todas as áreas da placa e não a perturbe até que o ágar esteja completamente definido.
Em seguida, prepare as folhas de membrana de nitrocelulose usando uma tampa retangular da placa de Petri como modelo de rastreamento para que as folhas se encaixem na superfície da placa de desreplicação. Corte os lençóis e autoclave-os em uma bolsa estéril. Agora, verifique a placa de controle de esterilidade para garantir que não haja contaminantes após seis dias de incubação.
Se não for contaminação, remova a tampa da placa de Petri retangular e a pipeta 200 microliters da cultura de sementes na superfície do ágar bennett no prato retangular. Use um cotonete estéril para espalhar uniformemente a cultura pela superfície de toda a placa. Para posicionar a membrana de nitrocelulose preparada sobre o topo da cultura na superfície da placa de Petri, alinhe a borda inferior da membrana até a borda inferior da placa de Petri e aplique lentamente a membrana da borda inferior até a borda superior da placa.
Use um cotonete estéril para suavizar quaisquer bolhas de ar que possam ter se formado entre a interface do ágar da membrana, garantindo que a membrana esteja alinhada ao ágar. A membrana permite que os organismos esporulem em sua superfície, enquanto metabólitos secundários podem ser excretados para o meio abaixo. Coloque a tampa de volta na placa de Petri retangular e coloque-a de cabeça para baixo em um saco plástico selado.
Incubar a 30 graus Celsius por seis dias. Após seis dias, remova a placa de desreplicação da incubadora. Usando pinças estéreis, remova cuidadosamente a membrana de nitrocelulose da superfície do ágar bennett.
Certifique-se de que há apenas um pequeno crescimento de esporos ao redor das bordas da placa para diminuir as chances de contaminar a sobreposição a ser adicionada. Certifique-se de que a superfície de trabalho esteja nivelada e use uma pipeta sorológica para aspirar 23 mililitros de ágar MHB ajustado de cáção quente. Crie uma sobreposição distribuindo 20 mililitros uniformemente através da superfície da placa de dereplicação, deixando o restante do ágar na pipeta para evitar a formação de bolhas de ar.
Coloque a tampa na placa. Gire suavemente a placa até que o meio cubra todas as áreas e não a perturbe até que o ágar esteja completamente definido. Uma vez resfriado e solidificado, devolva a placa de dereplicação ao saco plástico selado e armazene-a de cabeça para baixo a quatro graus Celsius durante a noite, permitindo a difusão de metabólitos secundários na sobreposição de ágar MHB.
No mesmo dia, inocular um modelo ARP ou MARP fresco, primeiro pipetting 100 microliters de cation ajustado MHB em cada poço de uma placa de 96 poços. Tire o estoque congelado ARP ou placa de biblioteca MARP do congelador menos 80 graus Celsius. Remova o selo de alumínio antes que a condensação comece a se formar na parte inferior.
Usando ferramentas de fixação estéreis de 96 poços, fixar cuidadosamente a partir do estoque congelado placa de biblioteca ARP ou MARP e inocular o MHB fresco contendo placas de 96 poços. Para minimizar a contaminação durante a dereplicação, prepare quantas placas de biblioteca ARP ou MARP necessários para desreplicar apenas duas a três placas de dereplicação por placa de biblioteca. Uma vez concluído, coloque uma nova vedação de alumínio estéril no modelo congelado e devolva-o ao congelador de menos 80 graus Celsius.
Coloque as placas de 96 poços inoculadas dentro de um saco plástico selado e incubar a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM por 18 horas. Remova o modelo ARP ou MARP da incubadora e certifique-se de que não há contaminantes, comparando a placa ao mapa do modelo ARP ou MARP. Remova as placas de derreplicação a partir de quatro graus Celsius e deixe equilibrar a temperatura ambiente.
Se houver condensação, abra as tampas e deixe secar em um ambiente estéril. Utilizando ferramentas de fixação estéreis, pino da placa de biblioteca ARP ou MARP sobre a superfície da sobreposição de ágar MHB das placas de derreplicação. Tenha cuidado para não furar o ágar.
Deixe o modelo inóculo secar por três a cinco minutos. Coloque as placas de dereplicação inoculadas de cabeça para baixo em um saco plástico selado e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, analise os resultados da derreplicação comparando o crescimento da placa de desreplicação com os poços que correspondem ao mapa ARP ou MARP.
Neste fluxo de trabalho de dereplicação ARP ou MARP, obteve-se um resultado positivo de dereplicação. Em que o extrato preparado para a cepa WAC 8921 foi identificado como um produtor de clorofenicol. A falta de crescimento de ARP indica a presença de um antibiótico desconhecido ou de um antibiótico menos comumente encontrado que não foi contabilizado na placa de biblioteca ARP ou MARP.
Um padrão de crescimento exclusivo do MARP foi formado devido à sua utilização tanto do tipo selvagem E.coli BW25113 quanto de um mutante hiper-permeável e deficiente e-flux E.coli BW25113 bamB tolC. Este resultado sugere a presença de um composto com atividade antimicrobiana que não foi capaz de superar uma membrana externa intacta. Estes padrões de crescimento de E.coli sugerem a esterilização inadequada de ferramentas de fixação, resultando na transferência de cepas E.coli desconhecidas através da sobreposição.
E um exemplo de contaminação da placa de biblioteca congelada ARP ou MARP é mostrado aqui com três colônias distintas de E.coli cultivadas na superfície retangular da placa de Petri. Este resultado indica que a sobreposição de ágar foi perfurada durante a dereplicação. A contaminação relacionada à sobreposição do MHB também pode ocorrer durante o processo de derreplicação, mostrando um padrão de crescimento irregular na superfície da sobreposição.
A coisa mais importante a ser lembrada ao seguir este protocolo é usar técnicas adequadas de esterilização e assépticas, a fim de garantir que você não seja retido em nenhuma etapa devido à contaminação. Isso inclui o preparo da membrana de nitrocelulose para que se encaixe na superfície da placa de ágar do Bennett o mais próximo possível, a fim de minimizar a propagação de esporos ao derramar a sobreposição de MHB. Além disso, também é extremamente importante usar equipamentos de fixação devidamente esterilizados ao vacinar as placas da biblioteca e desreplicar para produzir o resultado mais limpo.
Além de desreplicar antibióticos conhecidos, este método pode ser aplicado à identificação de adjuvantes que podem ser usados em conjunto com antibióticos existentes para resgatar sua atividade. Embora a dereplicação de antibióticos não seja uma técnica nova, é notória por ser intensiva em recursos e demorada. A plataforma ARP e MARP ajudam a esclarecer como a dereplicação de antibióticos não precisa ser uma grande produção, mas pode ser concluída durante um período de duas semanas usando equipamentos mínimos.
