Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa do NCI Research intramuros.

1. Preparação de Stocks mestre <ol><li> Fazer stocks mestres dos compostos a ser ensaiados em DMSO. Prepare ações a uma concentração padrão de 20 mm. Nota: qualquer concentração acima de 10 mM pode ser utilizada. Os compostos que podem ser utilizados como controlos positivos para validar este ensaio incluem RAL, EVG e DTG. </li><li> Assegurar os compostos são dissolvidos em DMSO em vortex as soluções múltiplas vezes durante 15 seg e incubar à TA durante 1 hora. Armazenar as soluções de estoque 20 mM no escuro a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Preparação das placas de 96 poços para rastreio Composto <ol><li> Escolha da linha celular a ser testada (por exemplo, HOS ou TZM-bl), e semear 100 ml dessas células a uma densidade de 4 x 10 4 células / ml (4.000 células / poço) em meio (por exemplo, de Eagle modificado da ou DMEM meio de Dulbecco suplementado com 5% (v / v) de soro fetal bovino, 5% de soro de bezerro recém-nascido, e penicilina (50 unidades / ml) com estreptomycin). </li></ol> 3. Geração dos stocks de vírus Produção de VSV-G pseudotipado-HIV através da transfecção de células 293 (como mostrado na Figura 1, passo 1) 32-34. <ol><li> No dia antes da transfecção, as células prato 293 sobre placas de 100 mm de diâmetro a uma densidade de 1,5 x 10 6 células. </li><li> No dia da transfecção, transfectar células 293 com 16 ug de tipo selvagem ou mutante de HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) e 4 ug de VSV (pHCMV-g), usando o método de fosfato de cálcio 35. </li><li> Aproximadamente seis horas depois de o precipitado de fosfato de cálcio é adicionado, lavar 293 células duas vezes com tampão fosfato salino (PBS) e incuba-se com o meio fresco durante 48 horas. [DMEM suplementado com 5% (v / v) de soro fetal bovino, 5% de soro de bezerro recém-nascido, e penicilina (50 unidades / ml) mais estreptomicina (50 ug / ml)]. </li><li> Recolher o vírus contendo sobrenadantes removendo a mídia do 100 mm de diâmetropratos, esclarecer-se os sobrenadantes por centrifugação a baixa velocidade a 3000 rpm, durante 10 minutos, filtrar o sobrenadante através de um filtro de 45 um de tamanho de poro de seringa, tratam-se os sobrenadantes com Turbo DNase por 30 min à temperatura ambiente e dilui-se os sobrenadantes em suportes para a preparação em ensaios de infecção . Armazenar os sobrenadantes virais congelado, em ali quotas, a -80 ° C. Nota: a quantidade de p24 no sobrenadante é determinada por meio de um kit de ensaio imunossorvente de p24 de HIV-1 ligado a enzima. A concentração de p24 é utilizado para controlar a quantidade de vírus na amostra. Aproximadamente 500 ng de vírus é adicionado a células HOS semeadas em pratos de 60 milímetros de diâmetro, a uma densidade de 1,5 x 10 5 células / placa no dia anterior à infecção. Depois de 48 horas de incubação, as células são colhidas, recolhidas por centrifugação, lavadas e ressuspensas em 100 ul de PBS. Adicionar uma quantidade igual de reagente de ensaio de luminescência repórter gene e medir a atividade luciferase conforme descrito nas seções 5.4.1 e5.4.2. A partir daí, uma diluição apropriada do vírus pode ser feito, como discutido no passo 4.6. </li></ol> 4. Composto de Triagem em placas de 96 poços Tela cada composto em triplicado e média dos resultados. Nota: o efeito de cada composto na replicação viral é corrigida através da normalização do nível de replicação obtida na ausência de qualquer composto. <ol><li> Determinar o intervalo de concentração empírica para ser exibido. Nota: normalmente, com telas de 11 diluições seriadas são feitas através da adição do composto com a placa coluna por coluna e com telas de 7 diluições em série são feitas através da adição do composto de linha. Uma triplicado conjunto de poços deve ser reservado para o controle nenhum composto. Além disso, uma coluna ou uma linha deve permanecer vazio para actuar como controlo negativo / fundo. Por último, se se trata de uma citotoxicidade celular ou ensaio de infecciosidade vai ditar se é adicionado vírus. </li><li> Preparardiluições em série a partir da solução de reserva 20 mM. As concentrações são escolhidos em função da gama de concentrações determinada empiricamente a ser testados (como mostrado na Tabela 1). Preparar as diluições em mídia em 10x a concentração final desejada, ou seja, se a concentração final vai ser 100 M, faça um estoque de trabalho 1 mM. Nota: compostos com IC 50 s acima 5-10 mM geralmente não são bons candidatos para o desenvolvimento de drogas. Nos ensaios iniciais, testar os compostos apenas contra o vetor WT. Compostos promissores que inibem eficazmente o vector WT são então testados contra um painel de mutantes resistentes aos medicamentos. </li><li> Retirar as placas de 96 poços a partir da incubadora e adicionar as diluições em série dos compostos a ser ensaiados para os poços, em triplicado, (como mostrado na Figura 1, etapa 2). Nota: o volume adicionado ao poço deverá ser de 1/10 do volume da concentração final. Assim, adicionar 22 ul / poço (volume final de pAlém vírus ost é de 220 mL) para ensaios de infecciosidade. Para os ensaios de citotoxicidade, adicionar 11 ul / poço (volume final é de 110 uL / ​​poço). </li><li> Devolver as placas de 96 poços para a incubadora. Para uma tela de citotoxicidade celular, incubar as placas de 96 poços de 48 horas a 37 ° C e não mais manipulações são necessários no Protocolo 4: proceder ao protocolo 5 Para Ensaios de infectividade, continue seguindo as instruções no Protocolo no 4.. </li><li> Ensaios de infectividade só. Retirar as placas do incubador, após um mínimo de 3 horas de incubação a 37 ° C com os compostos a serem analisados. Nota: isto permite que o composto seja absorvido pelas células antes da infecção com o vector de HIV. </li><li> Prepara-se uma diluição de estoque de vírus 33, 34 (geralmente cerca de 1:3) de modo a produzir um sinal de luciferase entre 0,2-1,5 unidades de luciferase relativas (RLUs) em células não tratadas. Uma placa inteira demora cerca de 10 ml de diluiçãovírus ted. Adicionar 100 ul de vírus a cada um dos poços, utilizando um 8 ou 12 pipetador multicanal. Não adicionar o vírus para os poços de controlo negativo / fundo. Retorne os pratos para a 37 ° C incubadora por 48 horas. Nota: uma diluição 1:03 de estoque de vírus é a diluição típico que vai produzir um sinal da luciferase, entre 0,2 -1,5 RLUs baseado num ensaio de p24 que mostra que a concentração de vírus no sobrenadante é de cerca de 500 ng em 1,0 ml. </li></ol> 5. Preparação e medição de citotoxicidade e infectividade em placas de 96 poços <ol><li> Aspirar a mídia dos poços (vermelho de fenol na mídia pode interferir com o sinal luciferase). Usar uma pipeta de vidro com uma ponta de pipeta de 200 ul ligado à extremidade. Comece no topo da mídia e trabalhar lentamente em direção ao canto inferior do poço. Não gastar demasiado tempo na parte inferior do poço, ou as células podem ser removidas a partir do poço. </li><li> Adicionar 100 l de PBS suplementado com 0,5 mM MgCl 2 a cada poço. Isso precisa ser feito imediatamente após a mídia é removido para que as células não sequem. </li><li> Apenas para testes de citotoxicidade, adicionam-se 5 ml de tampão de substrato a partir do ensaio de detecção de luminescência de ATP a cada frasco de reagente liofilizado fornecido. Um frasco é suficiente para uma placa de 96 poços. <ol><li> Adicionar 50 ul de tampão de lise de células a partir do ensaio de detecção de luminescência de ATP a cada poço. Agitar a placa de 96 poços a 700 rpm a temperatura ambiente durante 5 min, utilizando um termomisturador compacto. </li><li> Adicionar 50 mL de reagente reconstituído teste de detecção de luminescência ATP em todos os poços, exceto para os negativos poços controle / fundo. Agitar a 700 rpm à temperatura ambiente durante 5 min, utilizando um termomisturador compacto. Incubar as placas à temperatura ambiente durante 20 minutos para dar tempo para o desenvolvimento de sinal. </li><li> Ler a placa de 96 poços, utilizando o luminómetro de microplacas. Nota: abrir o programa de microplacas luminometer SoftMax Pro. Verifique se o luminometer está definido para medir luminescence com uma sensibilidade de 5 leituras / poço. </li></ol></li><li> Apenas para ensaios de infecciosidade, adicionar 10 ml de tampão de substrato de ensaio do gene repórter de luminescência de cada frasco de reagente liofilizado fornecido. Um frasco é suficiente para cada placa de 96 poços. <ol><li> Adicionar 100 ul de reagente de ensaio de repórter reconstituído gene de luminescência em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para dar tempo para o desenvolvimento de sinal. </li><li> Ler a placa de 96 poços, utilizando um luminómetro de microplacas como é realizada na secção 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Determinação de CC50 e os valores de IC50 para os Compostos <ol><li> Transfira os dados de luciferase do luminometer microplaca em uma planilha excel. <ol><li> Média de ambos os dados de luciferase, em triplicado, e os dados de sinal de fundo / controlo. Subtrair o sinal média de fundo / controle do sinal de média triplicado para toda a faixa de concentração. </li> &lt;li&gt; Normalizar o fundo corrigido sinal médio para a gama de concentrações contra a actividade, quer seja a citotoxicidade ou a infectividade, na ausência de qualquer composto para determinar a percentagem de inibição. Nota: a percentagem de inibição é definida como a actividade da luciferase na presença de droga dividida pela actividade da luciferase na ausência de droga multiplicada por 100. </li></ol></li><li> Usar o software Kaleidagraph para obter CC 50 e os valores de IC50 <ol><li> Transferir tanto a gama de concentrações determinada empiricamente e a percentagem de inibição da actividade da luciferase em Kaleidagraph. </li><li> Graficamente os dados com o intervalo de concentração no eixo do X e a percentagem de inibição da actividade da luciferase sobre o eixo y. </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descreve-se um ensaio rápido, eficiente e reprodutível, que pode ser utilizado para rastrear compostos quanto à citotoxicidade e à sua capacidade para inibir a replicação de ambos WT e resistentes de HIV-1 da droga. A capacidade de identificar rapidamente os compostos e testar a sua eficácia e a citotoxicidade é crucial para o desenvolvimento de drogas novas e melhoradas contra o HIV-1. Uma vez que os compostos de chumbo são identificados, os análogos do composto de chumbo podem ser produzidos e testados usando o mesmo teste. O ensaio é relativamente simples. Há dois controles positivos e negativos que permitem ao usuário diagnosticar os problemas mais comuns (compostos tóxicos, problemas com o estoque do vetor). O uso de um conjunto de poços em triplicado sem composto adicionado mostra que a infecção viral ocorreu. O facto de a citotoxicidade é medida num ensaio independente misinterpreting evita uma redução da luciferase causada pelo citotoxicidade como um efeito específico sobre a replicação viral. As etapas críticasno protocolo estão a preparar as placas de modo que as células são distribuídos uniformemente em poços, os poços que têm as concentrações apropriadas dos compostos a serem testados, a adição da mesma quantidade de vírus a cada um dos poços, e medindo a actividade da luciferase para determinar o CC50 e os valores de IC50. O ensaio é segura, quantitativa, e reprodutível. O ensaio é seguro porque o vetor é a replicação defeituosa. O ensaio é quantitativo e reprodutível, pois baseia-se em um vector que expressa a única ronda de luciferase, que pode ser doseada com precisão e convenientemente. Em um ensaio de replicação do vírus de multi rodada, o IC 50 medido depende do número de ciclos de vida virais; este é um problema especial quando os ensaios envolve tanto WT e vírus resistentes a drogas que podem ter significativamente diferentes capacidades de replicação. Houve vários ensaios enzimáticos relatado anteriormente que podeser utilizados para o rastreio de inibidores de NOS. Os ensaios que envolvem a tecnologia de PCR em tempo real para medir o ADN integrado requerem proteínas recombinantes purificadas (s), e são, em geral, tanto mais trabalho intensivo e caro, 36, 37. Embora seja possível utilizar ensaios enzimáticos para medir o impacto de compostos nas outras enzimas virais (transcriptase reversa e protease), cada enzima requer o seu próprio sistema de ensaio. O vector de um ensaio de Fase, como descrito, pode ser utilizado, sem modificação, para o rastreio de inibidores de RT. Um ensaio semelhante pode ser utilizado para o rastreio de inibidores de protease; No entanto, num ensaio de inibidores da protease, os compostos devem ser adicionados para as células utilizadas para produzir os vectores. Um ensaio relacionado, usando diferentes células e vectores, pode também ser usado para o rastreio de envelope (env), e inibidores de fusão de entrada do HIV. Finalmente, o ensaio pode ser utilizado, em maior escala, com dispensadores robóticas automáticas. Assim, o ensaio pode ser utilizado para rastrear grandes bibliotecas de compostos contra WT e mutant HIV. No entanto, o facto de o ensaio pode detectar um inibidor da replicação do HIV, que actua em diferentes fases do ciclo de vida viral aponta para uma limitação na interpretação dos dados. Por si só, o ensaio não define qual o passo do ciclo de vida é bloqueado por um composto. Se esta questão que surge é, ele pode ser resolvido mediante a utilização de ensaios de tempo de adição 38, e por meio de testes do composto contra as proteínas virais recombinantes purificadas. Infelizmente, apesar do sucesso de drogas anti-VIH, ainda há problemas com ambos resistência e toxicidade. Na ausência de uma vacina eficaz contra o HIV anti, existe uma necessidade não só no desenvolvimento de novos fármacos terapêuticos que será eficaz contra os mutantes resistentes aos medicamentos existentes, mas também para o desenvolvimento de agentes profiláticos que podem reduzir a propagação do vírus. Se o uso profilático de medicamentos anti HIV incudes o tratamento de pessoas não infectadas, esta abordagem irá colocar uma carga especial no desenvolvimento de drogas que são têm little ou nenhuma toxicidade a longo prazo.

A disponibilidade de drogas que visam vários passos essenciais do ciclo de vida viral do HIV-1 levou a terapia de combinação de drogas (chamada terapia anti retroviral altamente activa, ou HAART) que melhorou grandemente o tratamento de infecções pelo HIV-1, e a sobrevivência a longo prazo dos pacientes. HAART, que geralmente usa combinações de dois (RT) e inibidores ou um inibidor da protease ou um inibidor não nucleosídeo da transcriptase reversa nucleosídeo RT, agora convertido uma doença mortal para uma condição de vida longa 1-5. No entanto, apesar dos muitos sucessos da HAART em supressão sustentada da replicação viral, tem limitações. HAART não erradicar o HIV, para que os pacientes não são curados e terapia é vida longa. Há problemas de toxicidade de drogas e com o surgimento de cepas resistentes aos medicamentos. A resistência pode surgir de todos os medicamentos anti HIV aprovados, incluindo os medicamentos recém-aprovados que visam integrase do HIV (IN). A resistência às drogas provavelmente surge becauso de mutações espontâneas que ocorrem durante a replicação viral (taxa de erro de 3 x 10 -5 ciclo mutações / base / replicação) 6. Quando mutações surgem nos genes que codificam para os alvos de drogas anti-retrovirais, de um pequeno subconjunto destas mutações irá levar a uma redução da susceptibilidade da estirpe viral para os medicamentos. Para evitar o desenvolvimento de resistência à droga, as concentrações de droga deve ser mantida em níveis que suprimem completamente a replicação do HIV. A fraca adesão ao regime terapêutico agrava o problema, e pode levar ao desenvolvimento rápido de resistência de 7-9. Embora as concentrações de fármaco pode variar em pacientes diferentes, devido a absorção, metabolismo, distribuição, e os níveis de excreção, as concentrações elevadas de drogas pode levar à toxicidade 10. Desde que a terapia continua para a vida do paciente, existem sérias preocupações de segurança sobre a toxicidade a longo prazo de anti retrovirais. Os anti retrovirais usados ​​em HAART podem ter efeitos adversos and tem havido incidentes onde os efeitos colaterais têm sido fatais 11-15. Os problemas encontrados com os pacientes do desenvolvimento da resistência e da toxicidade fundamentam a necessidade de desenvolver novas drogas que bloqueiam eficazmente a replicação de estirpes resistentes aos medicamentos comuns do vírus com pouca ou nenhuma toxicidade a longo prazo. Assim, existe uma necessidade de um ensaio que pode rastrear compostos que bloqueiam os passos essenciais do ciclo de vida viral rapidamente. Descrevemos aqui um ensaio eficiente que pode ser utilizado para avaliar a citotoxicidade de um compostos e a sua capacidade de bloquear a replicação de ambos WT e estirpes de VIH resistentes aos fármacos, rápida e eficientemente. O ensaio usamos é semelhante a um ensaio que foi desenvolvido para o rastreio de resistência a drogas em vírus isolados a partir de pacientes 16-18. Embora o ensaio pode ser usado sem modificação para o rastreio de compostos que podem bloquear a transcrição reversa do HIV, que se describe utilizando o ensaio para avaliar os inibidores de NO. IN é um enzima viral essencial que insere o ADN viral no genoma celular 19. Apesar de uma série de promissores em inibidores estão sendo desenvolvidos, alguns dos quais estão actualmente em fase de ensaios clínicos, apenas Isentress 20, 21 (também conhecido como Raltegravir ou RAL) e, mais recentemente, Elvitegravir (EVG) 22 e dolutegravir (DTG) 23 foram aprovado pela FDA. Estes compostos são activos tanto contra o VIH subtipos B e não B em cultura celular e em pacientes 24, 25. No entanto, o tratamento com RAL selecciona-resistentes a drogas de HIV-1 em mutantes, incluindo Y143R, N155H, e G140S/Q148H 24, 26-31. N155H e G140S/Q148H também reduzem a eficácia da EVG, que enfatiza a necessidade de projetar e desenvolver segunda geração inibidores de transferência de fio (INSTIs) que são eficazes contra estas mutações de resistência.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Apesar de uma série de medicamentos anti HIV foram aprovados, ainda existem problemas com a toxicidade e resistência aos medicamentos. Isto demonstra a necessidade de identificar novos compostos que podem inibir a infecção pelas estirpes de HIV-1 resistentes aos fármacos comuns, com uma toxicidade mínima. Descrevemos aqui um ensaio eficiente que pode ser utilizado para determinar rapidamente a citotoxicidade celular e eficácia de um composto contra estirpes virais WT e mutantes. A linha de células-alvo desejado é semeada numa placa de 96 poços e, após uma incubação de 24 horas, em série de diluições dos compostos a serem testados são adicionados. Não existem outras manipulações são necessárias para os ensaios de citotoxicidade celular; para anti HIV ensaia uma quantidade pré-determinada de qualquer um WT ou droga VIH-1 resistente vector que expressa luciferase é adicionada às células. A citotoxicidade é medida usando um ensaio de luminescência dependente de ATP e o impacto dos compostos sobre a infectividade é medido pela determinação da quantidade de luciferase na presença ou na ausência dos inibidores putativos. Este ensaio de rastreio leva 4 dias para se completar e vários compostos podem ser pesquisadas em paralelo. Os compostos são rastreados, em triplicado, e os dados são normalizados para os níveis de infecciosidade / ATP na ausência de compostos alvo. Esta técnica proporciona uma medição rápida e precisa da eficácia e toxicidade de potenciais compostos anti HIV.

Se o ensaio (Figura 1, os passos 1 e 2) foi realizada com sucesso, em seguida, os valores de luciferase deve assemelhar-se os dados apresentados na Tabela 2 varredura em toda a gama de concentração.; um composto potencialmente potente irá revelar o aumento da atividade da luciferase da esquerda para a direita, eo controle deve ter a maior atividade luciferase. Se a actividade da luciferase não exceda 0,1 Unidades de luciferase relativas (RLUs) em toda a gama de concentração, isto normalmente indica que o composto matou as células. Se os dados de luciferase é maior do que ou igual a 2,0 em todas as RLUs as diluições em série, em seguida, os compostos não foram capazes de inibir a infecção pelo HIV-1 nas concentrações testadas. Determinação da concentração dos compostos em relação a inibição percentual da actividade da luciferase em Kaleidagraph (Tabela 3, parte A), após a realização de análises de regressão linear, irá produzir resultados semelhantes para t<html> mangueira mostrado na Tabela 3, a parte B. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Preparação de VIH-1 Os estoques virais e de configuração de Citotoxicidade celular e uma única ronda infectividade ensaios. No passo 1, as células 293T são transfectadas com pNL4.3ΔEnv.LUC e VSV-G e incubadas durante 48 horas para produzir o vírus 34 . O vírus é colhido e armazenado (congelado a -80 ° C em alíquotas) até ser utilizado nos ensaios de infecciosidade. Para a etapa 2, células HOS são semeadas numa placa de 96 poços e incubadas durante 24 hr. As células são então pré-incubados com diluições em série dos compostos a serem testados durante 3 horas e, em seguida, infectadas com o vírus (ou WT ou resistente à droga). Após uma incubação de 48 horas, a actividade da luciferase é medida. &quot;width =&quot; 300 le1.jpg &quot;/&gt; Tabela 1. Drogas Triagem de série Prototype diluição. Uma triagem mais rigorosa envolve 11 diluições em série que normalmente começam em 10 mM e terminam em 0,0005 mM. As diluições são preparadas de 10x; há 100 ul de células e 100 ul de vírus em cada poço). Neste volume e seguindo estes cálculos, as diluições em série será suficiente para três fileiras de toda uma placa de 96 poços. Os ensaios de citotoxicidade são preparados de modo semelhante; porém as diluições 11 começam em 250 um e terminam em 0,05 mM. Apenas 11 mL das diluições são adicionados aos poços da placa que contém 100 ml de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Tabela 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabela 2. Luciferase Leitura do sinal de dados e Determinação da Percentagem de Inibição da Actividade de Luciferase. A tabela mostra dados de um conjunto típico de dados de luciferase de um composto bem sucedido. A tabela também mostra os cálculos adicionais necessários para determinar a percentagem de inibição da atividade da luciferase eo CC 50 e IC 50 valores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Tabela 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabela 3. Análise de Regressão Linear Tabela de Dados. Parte A. Representação gráfica do intervalo de concentração usado versus a percentagem de inibição da actividade da luciferase em Kaleidagraph produzirá as curvas de inibição adequadas. Parte B As curvas de inibição são definidos pela paramétrico 3função sigmoidal e ajuste aos dados de análises de regressão linear 18. Esta tabela de dados é então usado em conjunto com o Microsoft Excel para calcular as concentrações da droga necessária para inibir a integração vírus e de citotoxicidade celular em 50%, por exemplo, IC 50 e CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Aqui, descrevemos a citotoxicidade celular e ensaios de infecciosidade redondas únicas que permitem a triagem rápida e exacta de compostos para determinar a sua citotoxicidade celular (CC 50) e os valores de IC50 contra a WT e resistentes de HIV-1 da droga.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K visualizações.  National Cancer Institute.  Aqui, descrevemos a citotoxicidade celular e ensaios de infecciosidade redondas únicas que permitem a triagem rápida e exacta de compostos para determinar a sua citotoxicidade celular (CC 50) e os valores de IC50 contra a WT e resistentes de HIV-1 da droga. 

Vídeo: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Imunologia e Infecção

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...