Células-tronco embrionárias humanas podem ser induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais e, posteriormente, em astrócito e oligodendrocyte neurônio. No entanto, o método de cultura do tipo para células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação em células progenitoras neurais são muito ineficientes e abertos sistema de co-cultura in vivo Aqui apresentamos um sistema de cultura melhorado e robusto que é facilmente escalável usando cultura de tipo de célula única de alta densidade com células-tronco embrionárias humanas. A cultura do tipo celular único das células-tronco embrionárias humanas fornece um sistema rápido e eficiente para estudar os mecanismos moleculares que regulam a diferenciação de várias etapas ao longo de várias e distintas linhagens diferenciadas, incluindo células progenitoras neurais e sua subsequente diferenciação em linhagens neurais adicionais.
Comece preparando células-tronco embrionárias humanas qualificadas para a matriz de membrana de porão. Descongele lentamente a solução da matriz da membrana do porão a quatro graus Celsius por pelo menos duas a três horas ou durante a noite. Quando descongelado, dilui a matriz em DMEM frio/F-12 a 2%, e cubra cada poço de uma placa de seis poços com um mililitro da solução diluída.
Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente por pelo menos três horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Para passar as culturas livres de alimentadores de células-tronco embrionárias humanas tipo H9 cultivadas na matriz de membrana do porão, aspirar o meio dos poços e lavar uma vez com um mililitro de DPBS. Adicione um mililitro de solução dispase a cada poço e incubar a placa a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Remova o Dispase e lave suavemente as células uma vez com dois mililitros de DMEM/F-12. Após a lavagem, retire o meio e adicione dois mililitros de DMEM/F-12 a cada poço. Desprendem suavemente as colônias, encanar para cima e para baixo e transferi-las para um tubo de 15 mililitros.
Centrifugar o tubo a 370 vezes g por dois minutos. Aspire o meio. Em seguida, dissociar as pelotas celulares em células únicas adicionando dois mililitros de solução de descolamento celular e incubando-as a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Repita a centrifugação e remova a solução de desprendimento. Resuspenque as células no meio ESC humano mTeSR-1, tubos suavemente para cima e para baixo. Para adaptar as células-tronco embrionárias humanas ao tipo de célula única, a placa de aproximadamente 1,5 a dois milhões de células em cada poço da matriz de membrana do porão placa revestida em dois mililitros de mTeSR-1 contendo 10 inibidores de ROCK micromolar.
Após 24 horas, substitua o meio por mTeSR-1 fresco sem inibidor ROCK. Permita que as células cresçam como um único tipo de célula por três dias mudando o meio diariamente. No quarto dia, dissociar as células em solução de descolamento e replacá-las como descrito anteriormente.
Depois de reutilizar e incubar as células de acordo com as instruções do manuscrito, transfira os pequenos corpos embrionários para um tubo de 15 mililitros, deixe-os se acomodarem ao fundo e removam suavemente o meio com uma pipeta. Transfira-os para o meio EB e permita que eles se expandam em pratos de baixa fixação por sete dias. Para induzir a diferenciação de célula progenitora neural ou NPC, dissociar as células-tronco embrionárias humanas do tipo único com um mililitro de solução de descolamento e incuba-las a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Centrifugar as células por dois minutos a 370 vezes g. Remova a solução de desprendimento supernaspendo. Em seguida, resuspende as células em DMEM/F-12.
Placa as células em uma matriz de membrana de porão revestida placa de seis poços a uma densidade de duas vezes 10 para as quintas células por poço em dois mililitros de mTeSR-1 com 10 inibidores de ROCK micromolar. Após 24 horas, substitua o meio de cultura por meio de indução neural suplementado por um micromolar Dorsomorphin e cinco micromolar SB431542. Mude o meio a cada dois dias durante os primeiros quatro dias de indução neural, então todos os dias até que a confluência seja alcançada no sétimo dia.
Após sete dias de indução neural, dissocia as células adicionando um mililitro de solução de descolamento e incubando-as por 10 minutos a 37 graus Celsius. Centrifugar as células a 370 vezes g e remover a solução de descolamento supernadante. Adicione um mililitro de expansão NPC médio e suavemente pipeta as células para cima e para baixo para resuspend.
Em seguida, placa uma vez 10 para a quinta células por poço em dois mililitros de meio de expansão NPC na matriz de membrana do porão revestido placas de seis poços. Transe as células conforme necessário quando as culturas atingirem 90% de confluência adicionando 10 inibidores de ROCK de micromolar durante as primeiras três ou quatro passagens. Mude o meio a cada dois dias durante a expansão.
Para preparar placas revestidas de laminina da OLP, diluir a solução de estoque de PLO em PBS ou água para uma concentração final de 10 microgramas por mililitro, misture bem, depois cubra cada poço de uma placa de seis poços com um mililitro da solução. Incubar as placas por pelo menos duas horas a 37 graus Celsius ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave cada poço com PBS e logo após revestir cada poço com um mililitro de solução de laminina preparado de acordo com as instruções do manuscrito.
Mantenha as placas a 4 graus Celsius por até uma semana. Para diferenciar os NPCs em neurônios dopaminérgicos, emplaque as células em pratos revestidos de laminina da OLP em meio de expansão NPC a uma densidade de aproximadamente 50%Após 24 horas, mude o médio para o DA1 e mude o meio a cada dois dias depois disso. Para as culturas de passagem quando atingem a confluência, dissociar as células com um mililitro de solução de desprendimento e incuba-las por 10 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, centrifuá-los a 370 vezes g e remover a solução de descolamento supernatante. Resuspenque as células em um mililitro de média DA1 e placa uma vez 10 para a quinta células em dois mililitros de médio na placa de seis poços revestidas de laminina da OLP. Para diferenciar os NPCs em astrócitos, emplaque as células nas placas de laminina da OLP e o meio de expansão do NPC a uma densidade de 50% alteram o meio médio para o astrócito após 24 horas, e passagem as células como descrito anteriormente.
Quando as células-tronco embrionárias humanas do tipo colônia foram adaptadas à cultura do tipo célula única, descobriu-se que as células eram capazes de ser mantidas em alta densidade, então subculturadas de forma fácil e eficiente quando a confluência era atingida. Essas células mantiveram as características do ciclo celular típicas de células-tronco embrionárias do tipo colônia humana, como uma fase G1 curta e uma alta proporção de células na fase S. A análise quantitativa do PCR também confirmou que eles expressam marcadores ESC em níveis comparáveis aos das células do tipo colônia.
Além disso, foi demonstrado que células-tronco embrionárias humanas de células únicas foram capazes de formar corpos embrionários contendo células das três camadas de germes: endoderme, mesoderme e ectoderme. Foi então demonstrado que células-tronco embrionárias do tipo de célula única se diferenciavam eficientemente em NPCs, como indicado pela perda da morfologia típica das células-tronco embrionárias humanas e pelo aparecimento da morfologia do NPC. A diferenciação foi apoiada pelo aumento da expressão de marcadores NPC de assinatura e confirmada pela imunostaining e pela análise FACS.
A mesma análise também mostrou que mais de 90% das células mancharam positivo para proteínas SOX1, PAX6 e NCAM. Além disso, os NPCs derivados foram capazes de diferenciar-se em neurônios e astrócitos dopaminérgicos, como indicado pelo aparecimento de morfologias características e expressão de marcadores específicos de linhagem. Ao tentar este procedimento, é essencial emplacar as células-tronco embrionárias humanas em alta densidade, a fim de manter uma cultura de células-tronco embrionárias humanas saudáveis e indiferenciadas.
Este protocolo fornece uma plataforma para uma produção simples, robusta e escalável de células progenitoras e diferenciadas que serão escaláveis para estudo básico, tela de medicamentos e aplicação em medicina neurodegenerativa.
