Este protocolo introduziu um método livre de células alimentadores definidos para diferenciar células-tronco epiteliais membros da córnea de células-tronco pluripotentes humanas. As células-tronco epiteliais limbais são responsáveis pela renovação da epitelial córnea no olho saudável. Danos a essas células levam a uma condição conhecida como deficiência de células-tronco limbais, e à perda de clareza corneal.
Os métodos de cultura celular aqui mostrados permitem a produção eficiente de células-tronco epiteliais membros para futuras terapias de substituição de células córneas. Para começar, passar e manter o alimentador livre de cultura de células-tronco pluripotentes humanas, conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de usar apenas células-tronco pluripotentes humanas de alta qualidade como material inicial para diferenciações.
Quando estiver pronto para induzir a formação do corpo embrionário, aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente em uma coifa de fluxo laminar. Desvincule as células-tronco pluripotentes humanas livres para a suspensão adicionando 500 microliters de xeno free trypsin EDTA a cada poço. Uma incubação a 37 graus Celsius, com 5% de CO2.
Após três minutos, remova as células da incubadora e verifique a morfologia celular para determinar a fase ideal para a remoção da trippsina. Observe cuidadosamente as células para determinar o momento ideal para remover o EDTA de tentem livre xeno, quando as células tiverem arredondado, mas não se desvincularam completamente. No momento ideal, remova o xenófo livre de trippsina EDTA das células.
Adicione o inibidor de trippsina definido e a pipeta suavemente para desprender as células. Colete a suspensão de célula única em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrífuga a 300g por cinco minutos.
Em seguida, remova o supernasce, e resuspense as células em um mililitro de meio de cultura. Após a contagem das células, distribua de 2 a 3 milhões de células em três mililitros de meio de indução basal suplementado com cinco blebbistatina micromolar para cada poço de uma placa de seis poços de baixa fixação. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de CO2.
No dia seguinte, verifique a qualidade dos corpos embrionários sob um microscópio. Remova o meio e substitua-o por três mililitros de meio de indução basal suplementado com 10 micromolar SB-505124 e 50 nanogramas por mililitro do fator de crescimento de fibra de vidro básico humano. Continue incubando a 37 graus Celsius com 5% de CO2.
Nos dois dias seguintes, remova o meio e substitua-o por três mililitros de meio de indução basal, complementados com 25 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea quatro. Em seguida, continue a incubação usando as condições anteriores. No quarto dia, prepare uma mistura de 0,5 microgramas por centímetro quadrado de Laminin-521, e cinco microgramas por centímetro quadrado de colágeno placentário humano tipo quatro, diluído em DPBS contendo cálcio dois e magnésio dois íons.
Usando esta mistura, cubra os pratos de cultura tecidual de 100 milímetros para diferenciação aderente no volume total de revestimento de cinco mililitros por prato. Sele as placas e guarde-as a 4 graus Celsius durante a noite. No quinto dia, aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente em um capô de fluxo laminar.
Depois disso, retire a solução de revestimento e adicione 10 mililitros de meio de diferenciação pré-aquecido a cada prato. Usando uma pipeta, transfira os corpos embrionários de uma única placa bem em dois ou três pratos de cultura de tecido. Em seguida, agite suavemente cada prato de cultura para distribuir uniformemente os corpos embrionários.
Mantenha as células na cultura aderente a 37 graus Celsius com 5% de CO2 pelas próximas duas semanas e meia a três semanas, certificando-se de substituir o meio por 10 mililitros de média de diferenciação fresca três vezes por semana. Use um microscópio de contraste de fase para verificar regularmente as células para o surgimento da morfologia epitelial correta. Para começar, pré-aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente em uma coifa de fluxo laminar, exceto para o meio de criopreservação, que deve ser pré-refrigerado.
Em seguida, desprende as células-tronco pluripotentes humanas derivadas células-tronco epiteliais para suspensão de célula única adicionando xenófo livre trippsina EDTA e incubando a 37 graus Celsius com 5%DE CO2. Após cinco minutos, remova as células da incubadora e verifique a morfologia celular para determinar a fase ideal para a remoção da trippsina. Observe cuidadosamente as células para determinar o momento ideal para remover o xenófo livre trypsin EDTA, quando as células tiverem arredondado, mas não se desvincularam completamente.
No momento ideal, remova o xenófo livre de trippsina EDTA das células, e desprende as células como descrito anteriormente. Depois de contar as células, centrifuá-las a 300g por cinco minutos. Aspire o meio e resuspense as células em meio de criopreservação livre de xeno pré-refrigerado.
Usando uma pipeta, transfira a suspensão celular única para tubos criogênicos para que cada crio-tubo contenha entre 500.000 a um milhão de células em um mililitro de meio criopreservador. Coloque os tubos em um recipiente de congelamento. Dentro de cinco minutos, transfira-os para um congelador a 80 graus Celsius negativos para armazenamento durante a noite.
No dia seguinte, transfira os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Antes de descongelar as células, cubra todos os pratos e poços de pratos necessários com uma mistura de cinco microgramas por centímetro quadrado de colágeno placentário humano tipo quatro, e 0,5 microgramas por centímetro quadrado de LM-521, e pré-aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente na capa de fluxo laminar. Em seguida, retire a solução de revestimento dos pratos e poços de pratos e adicione o volume apropriado do meio de diferenciação pré-aquecido.
Adicione o meio de diferenciação pré-aquecido a um tubo cônico de 15 mililitros. Descongele as células rapidamente à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, transfira imediatamente a suspensão celular para o tubo de centrífuga cônica.
Centrífuga a 300g por cinco minutos. Aspire o meio e resuspense a pelota celular em meio de diferenciação para remover qualquer meio de criopreservação. Coloque as células em pratos pré-revestidos em meio de diferenciação a uma densidade de 40.000 a 50.000 células por centímetro quadrado.
Mantenha as células a 37 graus Celsius a 5% de CO2, substituindo o meio de diferenciação três vezes por semana. Em Laminin-521, o alimentador de alta qualidade indiferenciado livre células-tronco pluripotentes humanos primeiro forma colônias distintas com bordas afiadas, que se fundem a monocamadas homogêneas em confluência. Cultivo em meio de indução basal, suplementado com cinco blebbistatina micromolar por 24 horas tipicamente produz uma suspensão de corpos embrióides apertados e regulares de vários tamanhos, enquanto a morfologia corporal embrióide não deve mudar drasticamente durante a indução ectodérmica superficial em suspensão, o crescimento colonial é visto aparecendo logo após os corpos embrióides serem banhados no colágeno tipo quatro e matriz de combinação Laminin-521 em meio de diferenciação.
Dentro de 21 a 25 dias de diferenciação, as células formam camadas homogêneas confluentes, com morfologia poligonal, que é típica das células epiteliais. As células podem ser então armazenadas crio armazenadas para uso posterior, pois a viabilidade e a morfologia são bem preservadas após o descongelamento. No dia 24 de diferenciação, a grande maioria das células expressou proteína de caixa emparelhada, PAX6, o principal regulador do desenvolvimento dos olhos, bem como p63 alfa, o marcador LESC amplamente reconhecido.
Delta Np63 é coexpresso na maioria das células alfa positivas p63, confirmando o mais específico delta Np63 alfa positivo phenotype. Outros marcadores são expressos em parte, enquanto outros são indetectáveis neste ponto, indicando que a diferenciação progrediu em direção aos progenitores epiteliais pericial unipotentes, mas a diferenciação terminal em células epiteliais córneas maduras ainda não ocorreu. Em média, cada célula-tronco pluripotente humana livre de indiferenciado gera 0,7 células até o dia 25.
Pelo menos 65% delta Np63 população de células alfa positivas pode ser esperada até o dia 24. A criopreservação purifica ainda mais a população celular. No geral, os métodos aqui apresentados são relativamente simples, mas há alguns pontos críticos para o sucesso.
A alta qualidade do material inicial é essencial, assim como técnicas suaves e fluentes de cultura celular em geral. Este protocolo fornece meios robustos para produzir células-tronco epiteliais membros para aplicações clínicas, bem como para vários fins de pesquisa. Além disso, o método pode ser facilmente modificado para diferenciação de células epiteliais de pigmento retiniano.
