O transplante de ilhotas é uma das abordagens mais promissoras para o tratamento do diabetes mellitus tipo I. E a busca por um local adequado para transplante de ilhotas está em andamento. O transplante de ilhotas para o tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é um método simples, mas eficaz, que pode ter implicações clínicas.
A extrapolação desse procedimento para a clínica pode levar ao desenvolvimento de uma cura para diabéticos tipo I. Este método poderia fornecer uma visão sobre o transplante de ilhotas clínicas, uma vez que o lingual foi determinado como não ser um local ideal para o enxerto de ilhotas. É importante acompanhar cuidadosamente cada etapa do procedimento, especialmente passos fundamentais, como a digestão do pâncreas.
A demonstração visual ajudará os pesquisadores a determinar melhor como realizar o isolamento da ilhota e a transmutação. Para a colheita de ilhotas, primeiro borrife a pele de um rato C57 preto de 10 semanas com 75% de etanol, e encha uma seringa de cinco mililitros com solução de colagem recém-preparada. Equipar a seringa com uma agulha de perfusão pontuda de 32 bitolas e coloque o rato na posição supina em um saco de gelo.
Use uma tesoura oftálmica pontiaguda reta para fazer uma abertura transversal na pele da área púbica, e estender a incisão em direção à cabeça do animal. Abra completamente o abdômen através de uma incisão em V da região púbica para o processo xifoide, e mova o fígado para expor a vesícula biliar e toda a extensão do ducto biliar comum. Em seguida, use um grampo vascular para fechar a abertura duodenal do ducto biliar comum e cortar uma pequena abertura na vesícula biliar.
Cannula o ducto biliar comum através da abertura com a agulha de perfusão previamente preparada, e injete aproximadamente dois mililitros de solução de colagem no pâncreas. Quando toda a colagem tiver sido entregue, use dois pares de pinças micro não invasivas para separar o pâncreas perfumado dos intestinos, estômago e baço, e coloque o pâncreas em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, adicione 100 microlitros de Dnase I por pâncreas aos tubos de 50 mililitros e agite vigorosamente cada tubo cerca de 40 vezes durante um período de 10 segundos antes de colocar os tecidos em um banho de água de 37 graus Celsius por três a cinco minutos com agitação moderada.
No final da incubação, adicione um volume final de 50 mililitros de Stop Solution para prender a digestão. E pulsar centrifuus os tubos a uma velocidade de 750 vezes G a quatro graus Celsius antes de parar rapidamente a centrífuga. Depois de descartar os supernacantes, lave as pelotas duas vezes em 15 a 25 mililitros de Stop Solution por lavagem sob as mesmas condições de centrifugação como apenas demonstrado.
Após a segunda lavagem, acumule três pelotas por tubo em novos tubos cônicos de 50 mililitros. E resuspensar as células pancreáticas em um volume total de dez mililitros de Histopaque 1119. Em seguida, adicione cuidadosamente cinco mililitros de Histopaque 1077 para baixo na lateral de cada tubo, seguido por cinco mililitros de HBSS.
Separe as células por centrifugação e use uma pipeta Pasteur de cinco mililitros para coletar as ilhotas da interface HBSS Histopaque 1077. Acumule as ilhotas em um novo tubo cônico de 50 mililitros em um volume final de 50 mililitros de Stop Solution para centrifugação de pulso, e descarte o sobrenatante. Resuspend a pelota em 30 mililitros de stop solution fresco para uma centrifugação de um minuto, e resuspend as ilhotas em 30 mililitros de cultura média.
Decante as ilhotas em um prato de cultura leve de 10 centímetros por tubo. E coloque o prato sob o microscópio estéreo. Usando 200 pontas de pipeta de carregamento de gel de 200 microliter, escolha a dedo as ilhotas esferoidais brancas da solução.
Colocando as ilhotas em um prato de cultura celular não tratada contendo 10 mililitros de cultura média à medida que são colhidas. Verifique a pureza das ilhotas escolhidas a dedo pela mancha de dithizone sob um microscópio leve. E detectar a viabilidade das ilhotas por fluorescetina diacetato propidídio manchando sob um microscópio florescente.
Em seguida, cultura as ilhotas isoladas em meio de cultura fresca a 37 graus Celsius em 95% de ar e 5% de dióxido de carbono até o transplante. Começando os dias três e quatro após a indução do diabetes, puna a veia caudal de cada rato C57 preto C57 de oito semanas por volta das 10:00 da .m. para coletar uma amostra de sangue de cada animal receptor.
Use um instrumento básico de monitoramento da glicemia para determinar o nível de glicose no sangue não em jejum de cada rato e, em seguida, adicione o sangue em tiras de teste individuais. Quando um animal tem demonstrado um nível de glicose no sangue de pelo menos 20 milimoles por litro dois dias seguidos, pese e marque o rato receptor e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal nos animais anestesiados. Coloque uma alíquota de hidrogel a partir de menos 20 graus Celsius de armazenamento no gelo para descongelar.
E transfira 450 a 500 equivalentes de ilhotas por destinatário em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro estéril contendo 200 microliters de médio por tubo no gelo. Co swab a área inguinal esquerda do receptor com 75% de etanol e coloque o mouse na posição supina. Conserte os membros com fita cirúrgica e use cortadores para remover os cabelos ao redor do local cirúrgico.
Co swab a área cirúrgica com iodophor e faça uma incisão vertical na pele desinfetada. Identifique a artéria epigástrica inferior e a veia dentro do ISWAT e crie um pequeno bolso acima dos vasos. Sedimentar as ilhotas por centrifugação e remover o máximo de supernanato possível.
Adicione 20 microliters de hidrogel descongelado em cada tubo, e resuspenque suavemente as ilhotas, tomando cuidado para evitar bolhas. Quando uma suspensão homogênea tiver sido obtida, use uma ponta de pipeta de 200 microliter para entregar cuidadosamente toda a mistura de hidrogel de ilhotas de um tubo no bolso. Quando o hidrogel se solidificar completamente, adicione 20 microlitadores de cefalosporina ao local do transplante, e feche o músculo e a pele com uma sutura cirúrgica contínua de 5-0.
Em seguida, coloque o destinatário em uma gaiola limpa em uma almofada térmica com monitoramento até a recumbência total. Após o processamento da ilhota murina como demonstrado, as ilhotas murinas isoladas serão suficientemente puras para transplante. Somente ilhotas isoladas com alta viabilidade devem ser usadas para transplante.
Após a mistura completa dos enxertos de ilhotas com hidrogel, o enxerto pode ser implantado no local iswat. Após cerca de um mês de transplante no ISWAT, os enxertos de ilhotas revertem a hiperglicemia, enquanto o peso corporal dos camundongos receptores aumenta gradualmente. Aos 100 dias após o transplante, a remoção dos enxertos resulta em um aumento imediato das 10:00.m.
nível de glicemia não em jejum. A análise histológica neste momento, revela que os enxertos de ilhotas permaneceram intactos. E a insulina e a coloração imunofluorescente glucagon indicam que as ilhotas transplantadas também estão funcionais em 100 dias após o transplante.
Tenha cuidado para não sacudir as células de pâncreas profusadas de forma muito robusta ou então a capacidade das ilhotas obtidas será comprometida. Ilhotas isoladas podem ser transplantadas sob a cápsula renal como um controle para comparar os efeitos do transplante isolado no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal no local. O procedimento adicionará o início de ensaios clínicos de transplante de ilhotas para outros locais além do fígado.
