A estimulação nervosa periférica está cada vez mais sob investigação como tratamento para uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias e distúrbios neurais. A construção de eletrodos de punho nervoso periférico cronicamente implantáveis para pequenos animais de laboratório pode ser demorada e cara. Este protocolo descreve uma abordagem simples e de baixo custo para a construção de eletrodos periféricos cronicamente implantáveis para uso em ratos.
O método requer muito poucos materiais e suprimentos de fácil acesso e um número reduzido de etapas perigosas ou tecnicamente exigidas em comparação com técnicas semelhantes que reduzem tanto o custo do dispositivo quanto o tempo necessário para treinar pessoal e montagem de dispositivos. Esta técnica foi projetada para permitir estudos pré-clínicos que testam a eficácia da estimulação nervosa crônica de Vegas durante a recuperação do derrame ou outros tipos de disfunção do Metrô. Comece preparando a tubulação de algemas.
Use uma lâmina de barbear para cortar um pedaço de tubo de polímero de 2,5 milímetros. Em seguida, insira um clipe de papel ou force pontas através da tubulação e faça um deslizamento longo através da parede da tubulação de um lado da braçadeira. Remova as fórceps da tubulação e insira uma agulha de costura grande através da linha média da braçadeira.
Coloque a agulha na placa de espuma para fixar a braçadeira no lugar durante as etapas restantes de montagem. Para colocar uma sutura para fixar o fecho da braçadeira durante a implantação, insira uma pequena agulha de costura através da parede da braçadeira na linha média aproximadamente cinco milímetros da fenda superior de um lado. Em seguida, insira dois centímetros de uma sutura de seis zero através do olho da agulha e puxe a agulha através da parede da tubulação para enfiar a sutura na braçadeira.
Furar um segundo buraco através da parede de tubulação aproximadamente cinco milímetros abaixo do primeiro buraco ao longo da linha média da braçadeira. Insira a sutura através do olho da agulha e puxe a agulha através da parede do tubo. Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV na extremidade curta da sutura que se estende do orifício inferior e puxe a extremidade mais longa da sutura até que a cauda inferior esteja quase alinhada com a parede externa do tubo.
Em seguida, cure o adesivo com uma varinha UV. Repita este processo para colocar outra sutura no lado oposto da braçadeira. Em seguida, o fio Platinum Iridium leva.
Use a pequena agulha de costura para fazer quatro furos na parede do punho. Em seguida, insira novamente a agulha de costura, desta vez trabalhando de exterior para interior através do primeiro orifício de chumbo. Insira aproximadamente cinco centímetros de um fio de Iridium platina de 7,5 centímetros através do olho da agulha e puxe a agulha através da tubulação para enfiar o fio de chumbo através da parede da braçadeira.
Ajuste o fio para que aproximadamente 4,5 centímetros se estenda no lado externo da braçadeira. Insira a agulha através do primeiro orifício de chumbo novamente, em seguida, através do segundo orifício de chumbo. Insira o ponto de cinco centímetros da extremidade mais curta do fio através do olho da agulha e puxe a agulha através da tubulação para enfiar o fio de chumbo através das paredes do punho.
Repita o processo para roscar o fio através do terceiro e quarto orifícios de chumbo. Usando um isqueiro butano, remova cuidadosamente o isolamento de cinco a seis milímetros dos fios que se estendem do segundo e quarto orifícios de chumbo Em seguida, puxe suavemente a extremidade do fio estendendo-se do primeiro orifício até que a porção não existente do fio esteja alinhada com o orifício. Repita isso com a outra ponta para alinhar a extremidade não ensulada do fio roscada através do terceiro e quarto orifícios de chumbo.
Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV nos laços de arame no lado externo da braçadeira no primeiro e terceiro orifícios de chumbo. Em seguida, use a varinha UV para curar o adesivo e fixar os cabos no lugar. Use uma pequena ponta de pipeta para empurrar os fios não-aplicados contra a parede interna da braçadeira.
Puxe as caudas de um milímetro do fio planas contra a superfície externa da braçadeira, tomando cuidado para não baixá-las juntas. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de adesivo UV para cobrir apenas as duas caudas e curá-la. Retire a agulha grande com o conjunto de punhos da placa de espuma.
Insira um comprimento de três centímetros de uma sutura de seis zeros através do olho da agulha e puxe a agulha através da tubulação para enfiar a sutura através da parte inferior da braçadeira no ponto médio. Insira a pequena agulha de costura através do mesmo orifício intermediário que funciona de interior para exterior para evitar a deformação, o tubo e os fios. Em seguida, insira a cauda exterior da sutura através do olho da agulha e puxe a agulha através da parede da braçadeira para criar um laço de sutura ao redor da borda da braçadeira.
Crie o segundo laço em torno da extremidade oposta da braçadeira amarrando as extremidades da sutura e meio nó no lado externo da braçadeira. Enquanto segura o nó plano contra a tubulação, aplique uma pequena quantidade de adesivo UV no meio nó e cure-o. Corte cuidadosamente as extremidades da rosca de sutura o mais perto possível do nó.
Em seguida, use um isqueiro de butano para remover o isolamento de aproximadamente três milímetros na extremidade de cada um dos fios de Iridium platina. Solde o lado da xícara de um pino de ouro para a extremidade não anulada de cada chumbo. Antes de prosseguir com o teste de implantação, a impedância do dispositivo montado para verificar se a braçadeira montada tem uma impedância de menos de dois quilos ohm a um quilohertz.
Depois de montar a tampa da cabeça e implantar os eletrodos de punho de acordo com as instruções do manuscrito, estimule o nervo vago enquanto o rato está acordado. Conecte o rato a um gerador de estímulo através da tampa da cabeça implantada e ajuste as configurações de estimulação. Para a reorganização induzida pelo VNS do mapa cortical motor, entregue um único trem de 15 pulsos bifásicos, cada um com uma largura de 100 microssegundos, e uma amplitude de 800 micro ampere em uma frequência de 30 hertz.
Um trem de estimulação é entregue imediatamente após a detecção de cada pressão de alavanca bem sucedida ao longo de 10, 30 minutos de treinamento. Use um osciloscópio para monitorar a entrega bem sucedida da estimulação atual. Este protocolo foi usado para implantar cronicamente eletrodos de punho nervoso vagus e tampas de cabeça em ratos.
Durante a implantação, a validação funcional de todas as algemas foi realizada por meio de testes para uma queda induzida por VNS na saturação de oxigênio no sangue. Para evocar essa resposta, um trem de 10 segundos de 30 pulsos de hertz, cada um com uma largura de 100 microssegundos, e uma amplitude de 800 micro ampere foi entregue através dos cabos de punho. Para todas as algemas, observamos uma cessação induzida por VNS de respiração durante a duração da estimulação de 10 segundos, que foi acompanhada por uma queda na saturação de oxigênio no sangue de pelo menos 5% confirmando a função do punho e a implantação adequada.
Para testar a funcionalidade de longo prazo dos dispositivos, os ratos foram anestesiados seis semanas após a implantação, e o VNS foi novamente aplicado. Para sete dos nove dispositivos, a magnitude da estimulação evocou mudança na saturação do oxigênio no sangue, não difere da observada na implantação inicial, sugerindo um excelente desempenho contínuo. Os dois dispositivos restantes, aumentando a amplitude de estimulação para 1,6 miliampere, foram suficientes para evocar uma redução confiável na saturação de oxigênio no sangue de pelo menos 5% sugerindo que esses dispositivos continuaram a funcionar.
Mas as mudanças na impedância, dano nos nervos ou orientação da braçadeira podem ter resultado em um desempenho reduzido. Para testar ainda mais a funcionalidade de longo prazo dos dispositivos cronicamente implantados, um segundo grupo de ratos foi treinado em uma versão simplificada de uma tarefa de prensa de alavanca de alcance qualificada. Os ratos foram obrigados a alcançar dois centímetros fora da cabine de treinamento para deprimir totalmente a alavanca e, em seguida, soltá-la dentro de dois segundos.
Consistente com estudos anteriores que demonstram que a estimulação do nervo vago impulsiona a expansão de representações relevantes do mapa motor, os ratos tratados com VNS apresentaram representações significativamente maiores do que os ratos tratados com Sham. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para acomodar experimentos de estimulação crônica em outras espécies de laboratório ou em outros locais nervosos periféricos, incluindo nervos ciáticos ou sacrais. Por exemplo.
