Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
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Os autores gostariam de reconhecer que esta pesquisa recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia para o projeto PATROLS, sob o acordo de subvenção nº 760813

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Os autores não têm nada a revelar.

As aplicações para modelos hepáticos 3D variam consideravelmente dependendo do ponto final bioquímico específico ou da via de desfecho adverso que está sendo alvo. Cada modelo tem seus benefícios e limitações, desde a variação interdonor nos modelos primários de hepatócito humano (PHH) até a redução da atividade citocromática p450 em modelos baseados em linha celular, mas todos são valiosos por si só6,12,18,19. Ao avaliar a genotoxicidade, há limitações na compatibilidade dos modelos com pontos finais aprovados pela regulamentação, como o ensaio de micronuclear in vitro, pois a proliferação ativa é necessária. Isso é necessário, pois a avaliação da genotoxicidade requer a quantificação de danos fixos de DNA a serem avaliados na divisão pós-celular quando há oportunidade de reparação de DNA para corrigir lesões transitórias. Infelizmente, hepatocitos altamente diferenciados (ou seja, esferoides baseados em HepaRG) ou microtissues PHH, que são considerados como apresentar as características hepáticas mais fisiologicamente relevantes formam modelos estáticos (não proliferativos)12,19,20. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 3D apresentado aqui fornece um modelo adequado e alternativo capaz de suportar testes de genotoxicidade. Os esferoides baseados em linha celular HepG2 têm células divisórias suficientes na superfície externa dos esferoides, mantendo características básicas semelhantes ao fígado, como a produção de albumina e ureia e alguma atividade CYP4505,12,19. Principalmente este modelo hepático in vitro foi desenvolvido para complementar o ensaio micronucleus, pois este é um dos dois ensaios in vitro recomendados na bateria para testes de genotoxicidade8,10,11,21. No entanto, o modelo pode ser facilmente aplicado às tecnologias de análise de sequenciamento de DNA e expressão genética (RNA), enquanto tem o potencial de ser ainda mais adaptado e utilizado para outros pontos finais de dano de DNA, como o ensaio do cometa. No entanto, é importante considerar o papel que a interferência do ENM desempenha em algumas análises de ponto final. Por exemplo, análises baseadas em citometria de fluxo podem não ser adequadas para avaliação de genotoxicidade enm especificamente devido à interferência de partículas22.
Um fator limitante dos modelos esferoides que se submetem ativamente à divisão celular é o seu tamanho. A otimização da densidade de semeadura é fundamental, pois é preciso haver células suficientes que permitam que o modelo continue a proliferar; mas não muito alto um número de células, o que resulta no esferoide se tornando excessivamente compacto, levando a um núcleo necrosado aumentado. Acredita-se que a causa dessa necrose seja a restrição de oxigênio e difusão de nutrientes, já que o limite dessa difusão é de aproximadamente 100 – 150 μm de tecido23,24. No entanto, isso depende do tipo celular, número celular, interações de andaimes e condições de cultura25. Desde então, foi demonstrado que aproximadamente 700 μm de diâmetro é o limite para evitar o início prematuro da necrose no centro de esferoides C3A, semeando 4000 células HepG2 por esferoide garante que o diâmetro do modelo no momento da exposição seja ≤500 μm26. Além disso, Shah et al. estabeleceram que as células HepG2 semeadas acima de 5000 células por esferoide apresentaram uma redução de 25% na viabilidade após 7 dias de cultura, o que poderia pertencer ao diâmetro médio de 680 μm e disponibilidade limitada de nutrientes em uma queda de 20 μL de suspensão5. Para superar isso, o modelo concebido no presente protocolo passa por um passo crítico onde a queda de enforcamento é transferida para poços revestidos de agarose após a formação inicial do esferoide. Isso garante um maior volume de cultura média está presente para sustentar o número crescente de células dentro dos esferoides. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 permanece mais de 70% viável após 10 dias de cultura e pode ser utilizado para avaliação de risco de longo prazo in vitro. 
Embora o modelo esferoide HepG2 possa suportar regimes de exposição aguda e de longo prazo, o meio de cultura celular refrescante durante períodos de cultura prolongado é restrito para este modelo, pois a substituição completa do meio não é aconselhada devido à perda potencial dos esferoides. Presume-se que, com as exposições enm, a tendência de dispersões homogêneas de ENM para aglomeração e sedimentos é alta. No entanto, é notável que a taxa em que um sedimento ENM pode variar dependendo dos parâmetros de partículas (por exemplo, tamanho, forma e densidade) e pode ser determinada teoricamente usando o modelo de sedimentação in vitro, difusão e dosimetria (ISDD), ou seus derivados recentes, muitas vezes referidos quando se aproxima da exposição ENM (suspensão) se aproxima27,28. Com isso é mente, supõe-se que se apenas 50% do meio de cultura celular for cuidadosamente removido da superfície da cultura celular, a interrupção e posterior remoção da dose ENM deve, em teoria, ser mínima. No entanto, com a moção browniana em jogo, isso pode não ser estritamente o caso e mais trabalhos na deposição e sedimentação de cada ENM em particular a ser testado devem ser realizados para garantir que a dosimetria correta seja mantida ao longo dos regimes de exposição a longo prazo27. Principalmente, esta é uma limitação potencial a ser considerada ao realizar regimes repetidos de dosagem, pois isso poderia ser fundamental para a concentração final e acumulada. Exposições baseadas em produtos químicos, por outro lado, embora não sem suas próprias limitações a considerar, oferecem uma abordagem mais simplista na forma de que as substâncias químicas tendem a permanecer em solução e, portanto, uma substituição direta da concentração química original, além da concentração recém-adicionada, garante que qualquer produto químico perdido durante o refresco da mídia seja substituído emconformidade com 29. Aplicações futuras incluiriam avaliar a adequação do modelo para regimes de exposição repetida em períodos de cultura de longo prazo, uma vez que estratégias de dosagem repetidas são crucialmente importantes para avaliar a capacidade de um determinado sistema de órgãos de amenizar ou superar os efeitos adversos, se houver, induzidos pela bioaccumulação de substância abiótica.
Em conclusão, este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar uma série de cenários de exposição realista, proporcionando assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar tanto a AVALIAÇÃO DE ENM quanto a avaliação de riscos químicos de forma rotineira e de fácil acesso.

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Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM) em uma infinidade de aplicações de base humana (por exemplo, alimentos, cosméticos, vestuário, equipamentos esportivos, eletrônicos, transporte e medicina), é inevitável que os seres humanos sejam expostos ao ENM regularmente. Com isso, há preocupações crescentes de que o novo, tamanho de características fisio-químicas específicas que considerem esses materiais vantajosos em inúmeras aplicações, possa causar efeitos adversos sobre a saúde humana e o meio ambiente concomitantemente. Atualmente, muitas atividades internacionais estão em vigor para refletir ativamente exposições mais fisiologicamente relevantes a esses ENM e avaliar a toxicidade potencial desses materiais em cenários de exposição aguda, de longo prazo e repetidos de baixa dose.
Toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois é amplamente conhecido que o fígado é um dos principais locais de acumulação de ENM pós exposição1,2. Além disso, o fígado é o sistema de órgãos primários para metabolismo e desintoxicação de substâncias que entram em circulação sistêmica3. Com base no entendimento aceito de que modelos hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades de interações multicelulares intrincadas ou representam adequadamente a atividade metabólica observada in vivo, um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos in vitro 3D robustos e fisiologicamente relevantes para tecnologias substitutas in vivo foi estabelecido4,5. A utilização de tecnologias avançadas de cultura 3D melhora a longevidade de modelos hepáticos in vitro, permitindo que regimes de exposição repetidas e de longo prazo sejam investigados. Além disso, esse formato de cultura avançada promove a formação de características fisiológicas e organotípicas aprimoradas, como bile canaliculi, processos de transporte ativo e capacidades de metabolização de medicamentos CYP450 aprimorados, melhorando assim a previsibilidade dos modelos6. Modelos hepáticos in vitro atuais 3D constituídos por monoculturas (somente hepatócitos) ou co-culturas (hepatócitos com células não equilíquicas) existem em vários formatos, desde microtissues ou esferoides em placas de aderência ultralow, esferoides de gota suspensa, células embutidas em matrizes e/ou andaimes e plataformas de cultura celular microfluida, todos os quais são considerados modelos avançados in vitro eficazes para avaliação de toxicidade hepática6,7. No entanto, a maioria desses sistemas de modelos são de alta manutenção, exigem equipamentos especializados e são caros. Além disso, esses modelos são frequentemente estáticos (ou seja, modelos de células nãondividing) que impedem seu uso na avaliação de pontos finais de perigo, como testes de genotoxicidade utilizando métodos que quantificam danos consertos de DNA. A genotoxicidade é um pré-requisito central na toxicologia regulatória, e é um componente vital da avaliação de risco de qualquer toxicante8. Não há um único ensaio que possa ser aplicado para quantificar todas as formas de dano de DNA que possam surgir após a exposição a um agente exógeno. No entanto, um componente central da bateria de teste de genotoxicidade in vitro é o ensaio de micronucleus, que é uma técnica confiável e multifacetada que mede danos cromossômicos brutos9. É uma técnica padrão-ouro descrita pela Diretriz de Teste da OCDE 487, para avaliação de danos in vitro de DNA e genotoxicidade e faz parte do requisito da bateria de teste para avaliação de risco regulatório10,11.
A linha celular hepatocelular humana, HepG2, é amplamente utilizada para a triagem inicial de avaliação de riscos, pois as células estão prontamente disponíveis, relativamente baratas à fonte, simples à cultura e amenáveis à triagem de alto rendimento12,13. Quando cultivadas em estruturas esféricas 3D, elas têm sido demonstradas para recapitular bem o microambiente hepático e oferecer um modelo hepático com capacidades proliferativas suficientes para suportar o ensaio de micronucleus3. Foi estabelecido mais desenvolvimento dos modelos esferoides HepG2 para melhorar a longevidade e a funcionalidade hepática do modelo, a fim de apoiar a avaliação de risco genotoxicidade em regimes de exposição repetidas a longo prazo (≤14 dias). Assim, em consonância com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, o presente protocolo foi estabelecido para fornecer um modelo hepático in vitro avançado 3D capaz de avaliar de forma confiável múltiplos pontos finais toxicológicos (por exemplo, funcionalidade hepática, (pro-)marcadores inflamatórios, citotoxicidade e genotoxicidade) seguindo exposições químicas agudas, de longo prazo e repetidas e ENM em uma rotina e de forma facilmente acessível.
Aqui, apresentamos um método para estabelecer uma linha de células hepatócitos 3D fisiologicamente relevante baseada em sistema de modelo in vitro para avaliação de risco de genotoxicidade após exposições agudas ou de longo prazo do ENM. O protocolo pode ser dividido em 6 estágios-chave: acultura de células HepG2 criopreservadas; Preparação de sferóide hepG2; Transferência de spheróide hepG2 de queda de suspensão para suspensão de agarose; Colheita de sferóides hepG2; ensaio micronucleus e pontuação; e análise de dados.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM), a exposição ao ENM é inevitável e o desenvolvimento de sistemas de teste in vitro robustos e preditivos é essencial. A toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois o fígado serve a um papel vital na homeostase metabólica e na desintoxicação, além de ser um dos principais locais de acumulação de ENM após a exposição. Com base nisso e no entendimento aceito de que os modelos de hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades das interações multicelulares intrincadas e da atividade metabólica observada in vivo, há um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos 3D fisiologicamente relevantes sob medida para fins de avaliação de riscos ENM in vitro. De acordo com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, foi desenvolvido um modelo hepático baseado em células 3D HepG2, que é um sistema fácil de usar e econômico que pode suportar regimes de exposição enm estendidos e repetidos (≤14 dias). Esses modelos esferoides (≥500 μm de diâmetro) mantêm sua capacidade proliferativa (ou seja, modelos celulares divisórias) permitindo que eles sejam acoplado ao ensaio de micronucleo 'padrão ouro' para avaliar efetivamente a genotoxicidade in vitro. Sua capacidade de relatar uma gama de pontos finais toxicológicos (por exemplo, função hepática, (pro-)resposta inflamatória, citotoxicidade e genotoxicidade) tem sido caracterizada usando vários ENMs em regimes de exposição agudos (24 h) e de longo prazo (120 h). Este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar exposições enm mais realistas, fornecendo assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar a avaliação de riscos ENM de forma rotineira e de fácil acesso.

A adequação deste modelo spheróide hepático 3D baseado em linha celular para cultura de longo prazo e avaliação de risco genotipico foi avaliada pela realização da caracterização da linha de base para determinar a viabilidade e funcionalidade hepática do modelo ao longo da duração de 14 dias na cultura, bem como sua aplicabilidade para o ensaio do micronucleus.
Caracterização da linha de base do modelo spheroid hepg2 hepg2 3D Antes de qualquer avaliação toxicológica in vitro, é importante verificar se os esferoides HepG2 3D formaram-se adequadamente antes de realizar a transferência de agarose ou tratamento químico/ENM. Os spheróides hepG2 produzidos usando o método de queda de suspensão geralmente levam de 2 a 3 dias após a semeadura (4000 células/esferoides) para formar esferoides compactos e esféricos com diâmetro médio de 495,52 μm W x 482,69 μm H, como mostrado na Figura 5A-5C. Os spheróides hepG2 que se formaram corretamente e são aceitáveis para serem usados para avaliação toxicológica in vitro devem ter uma estrutura compacta e esférica com uma superfície lisa e sem projeções visuais. A Figura 5 fornece exemplos de boa qualidade(Figura 5D-F) e um esferoides de má qualidade(Figura 5G-I). Este último deve ser descartado. Normalmente, 90-95% dos esferoides formados por placa se formarão corretamente e serão viáveis para novas experimentações.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figura 5: Imagens de microscopia leve que exibem a morfologia natural dos esferoidesHepG2 formadas através do método de queda de suspensão . (A-C) mostrar dia 2 e(D-I) Dia 4 HepG2 hefóides pós semeadura. (D-F) são exemplos de spheroids HepG2 de boa qualidade, enquanto(G-I) mostra esferoides mal formados. Todas as imagens foram tiradas em um objetivo X20 usando um microscópio. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para confirmar ainda mais a viabilidade esferoide HepG2, um ensaio colorido básico do Bromocresol Green Albumin (BCG) ou Urea Assay pode ser realizado para avaliar sua funcionalidade semelhante ao fígado. A funcionalidade semelhante ao fígado foi avaliada de acordo com a viabilidade usando o Ensaio de Exclusão Azul trypan durante um período de cultura de 14 dias para determinar a longevidade do modelo esferoide hepático e estabelecer se poderia suportar a avaliação de risco baseada em ENM/química a longo prazo(Figura 6). A concentração de albumina permaneceu consistente durante o período cultural. A produção de ureia apresenta um aumento na concentração de ureia produzida por esferoide ao longo de uma semana na cultura antes de atingir um patamar no dia 7. É importante notar que os níveis de albumina e ureia produzidos nos esferoides HepG2 3D são substancialmente maiores do que os observados na mesma linha celular cultivada em formato 2D. De fato, as culturas 2D das células HepG2, os níveis de pico de albumina e ureia foram de 0,001 mg/mL e 0,010 ng/μL, respectivamente. Além disso, em trabalhos anteriores publicados por Shah et al. utilizando um sistema esferoide HepG2 quase idêntico, os autores destacam uma notável melhora na atividade metabólica (CYP1A1 e CYP1A2) nos sistemas de modelos in vitro 3D HepG2 quando comparados com as células HepG2 cultivadas em 2D5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figura 6: Dados de caracterização da linha de base de 14 dias para esferoides hepG2 de fígado. Após a transferência da queda de suspensão, (A) destaca a viabilidade do modelo esferoide HepG2 durante um período de 14 dias, enquanto(B) e (C) destacam a funcionalidade de albumina e ureia semelhante ao fígado, respectivamente. Dados médios ± SEM apresentados, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Com o desenvolvimento inevitável de um núcleo necrosado, uma limitação conhecida das culturas esferoides hepáticos 3D, a viabilidade deste modelo baseado em HepG2 teve que ser estabelecida para demonstrar que era capaz de sustentar regimes de exposição a longo prazo (5-10 dias) mantendo a capacidade proliferativa necessária para suportar o ensaio micronucleus5. De fato, este modelo de spheroid hepático 3D tem sido mostrado para manter >70% de viabilidade ao longo de 10 dias na cultura. Com base nisso e em conjunto com a funcionalidade sustentada do fígado observada ao longo do período de cultura de ≥ 14 dias, este modelo de spheroid hepático 3D pode, assim, suportar regimes de exposição enm a longo prazo e repetidos até 10 dias de duração (ou seja, antes que a viabilidade dos esferoides caia abaixo de 70%). Para referência, é aconselhável que os níveis de albumina para spheróides HepG2 semeados em 4000 células/esferoides devem ser ≥20,0 ng/μL enquanto a produção de ureia deve ser ≥0,25 ng/μL antes de realizar uma avaliação toxicológica in vitro com este modelo.
Avaliação genotoxicidade de nanomateriais projetados Para avaliação da genotoxicidade, o ensaio micronucleus foi utilizado para determinar a presença de micronuclei após exposições enm agudas (24 h) e de longo prazo (120 h). Aflatoxina B1 é um conhecido carcinógeno hepático16,17 e é um controle positivo recomendado para o ensaio de micronucleus. Experimentos de otimização mostraram que 0,1 μM de AlfatoxinA B1 induz uma resposta genotoxica positiva (≥2,0 vezes) em esferoides hepáticos hepg2 3D e, portanto, é usada em todos os ensaios micronucleus realizados com este modelo. Para garantir a validade dos resultados do ensaio de micronuclear usando o modelo spheroid HepG2, a frequência de micronucleus de fundo para células HepG2 utilizadas neste modelo in vitro 3D deve estar dentro de uma faixa de 0,6% a 1,2%. Como resultado, a AlfatoxinA B1 deve induzir uma resposta genotoxica de pelo menos duas vezes maior do que a observada com o controle negativo; assim, 0,1 μM de Alfatoxina B1 deve induzir uma frequência micronuclei entre 1,5% e 3,0%. Usando esses parâmetros de controle, a genotoxicidade associada da ENM in vitro pode então ser avaliada de forma confiável. Com base na Diretriz de Teste da OCDE 487, é importante notar que, ao testar um ENM ou químico, as concentrações selecionadas não devem induzir mais de 55% ± citotoxicidade de 5% (indicada por uma redução dos valores de CPBI ou RVCC em relação ao controle negativo)11. A Figura 7 ilustra os dados gerados quando a AflatoxinA B1 e dois ENMs (dióxido de titânio (TiO2) e lasco (Ag)) foram avaliados após exposições agudas e de longo prazo nos esferoides HepG2, e o potencial genotóxico subsequente foi analisado usando o ensaio micronucleus. Ambos os ENMs avaliados foram testados em um regime noncytotóxico, de baixa dose de 5,00 μg/mL sobre uma exposição aguda (24 h) e regime de exposição a longo prazo (120 h). Uma tendência semelhante para genotoxicidade em ambos os ENMs TiO2 e Ag podem ser observadas, pela qual a resposta elevada de genotoxicidade que resultou após a exposição de 24 horas não ficou evidente após uma exposição de longo prazo de 5 dias. Isso foi apesar da genotoxicidade sustentada induzida pelo controle positivo da Aflatoxin B1 em ambos os pontos de tempo.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figura 7: Avaliação genotoxicidade após a exposiçãotio 2 e ag ENM em spheroids hepG2. Avaliação genotoxicidade (frequência de micronucleus) utilizando o posto de ensaio micronucleus(A) aguda (24 horas) e(B)exposição a longo prazo (120 horas) a 5,00 μg/mL de TiO2 e Ag ENM. O controle negativo é apenas uma mídia, enquanto o controle positivo é de 0,1 μM de Aflatoxin B1. Os dados médios (n=2) apresentaram ± SD. Significância indicada em relação ao controle negativo: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K visualizações.  Swansea University Medical School. Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

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Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Pesquisa do câncer

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioengenharia

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

A fibrose do fígado Modelo dimetilnitrosamina induzida no Rato

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Medicina

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Fundição de Resina Dupla seguida de Tomografia Microcomputada para Análise hepática 3D

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

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