Este trabalho foi em parte apoiado por Kansas INBRE, P20GM103418 para Li e Zinovyeva e R35GM124828 para Zinovyeva. Agradecemos a Min Han por compartilhar generosamente o anticorpo anti-AIN-1. Algumas das cepas utilizadas no decorrer deste trabalho foram fornecidas pelo Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC), financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Coleta de amostras de vermes
<ol><li>Fase mista de sementes ousincronizado 13 vermes em placas sólidas NGM na temperatura necessária e permitem que os vermes cresçam até o estágio desejado. Para o crescimento e manutenção básicos de C. elegans, consulte Stiernagle et al. e Porta-de-la-Riva et al.14,13.</li>
	<li>Colete vermes em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL lavando as placas de vermes com tampão M9.</li>
	<li>Pellule os vermes por centrifugação a 400 x g à temperatura ambiente (RT) por 2 min e descarte o supernasce. NOTA: O tamanho da pelota de verme para a preparação do extrato está entre 100 μL e 500 μL. Uma pelota de 300 μL de vermes embalados é recomendada para experimentos de imunoprecipitação a jusante e normalmente produz ~4,5 mg de proteína total, enquanto uma pelota de 500 μL produzirá ~7,5 mg de proteína total.</li>
	<li>Realize lavagens adicionais de 3 a 5 com tampão M9 (ver Tabela 1) ou até que o sobrenatante não esteja mais nublado.</li>
	<li>Realize uma última lavagem com ddH2O.</li>
	<li>Mova a pelota de verme solto para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e gire a 400 x g no RT por 2 min. Descarte o restante do supernante para obter uma pelota de verme embalada e prossiga para extrair a preparação. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As pelotas de verme podem ser congeladas em nitrogênio líquido imediatamente e armazenadas a -80 °C ou em nitrogênio líquido. Por favor, note que as pelotas de verme só podem ser descongeladas uma vez e não podem ser refrozenas.</li>
</ol>2. Extrair preparação da pelota de verme
NOTA: A preparação do extrato deve ser realizada no gelo ou a 4 °C.
<ol><li>Se congelado, descongele a pelota de verme no gelo. NOTA: Se o tamanho da pelota de verme embalado desejado de 300 μL não foi obtido durante a coleta de amostras, várias pelotas menores podem ser combinadas até que o material suficiente esteja presente para posterior extração.</li>
	<li>Adicione um volume igual de tampão de lise 2x lysis gelada (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM de cloreto de potássio, 0,1% Triton X, 4 mM de cloreto de magnésio, 10% glicerol, 2 mM DTT com inibidor de RNase, inibidor de protease e inibidores de fosfatase; ver Tabela 1) e vórtice ou pipeta para cima e para baixo para misturar. Gire o tubo para baixo para coletar a mistura na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Mova a mistura para um tubo sem RNase de 1,5 mL contendo contas metálicas (ver Tabela de Materiais) e coloque a amostra no homogeneizador do moinho de contas (ver Tabela de Materiais) a 4 °C. Certifique-se de que as tampas do tubo estão apertadas e as amostras são equilibradas dentro do homogeneizador.</li>
	<li>Homogeneize a amostra na velocidade mais alta (ajuste 12) por 4 min.</li>
	<li>Remova a amostra das contas e coloque-a em um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Alternativamente, um ímã fornecido com o homogeneizador pode ser usado para remover as contas da amostra.</li>
	<li>Gire o extrato a 19.000 x g por 20 min a 4 °C para esclarecer o extrato de proteína.</li>
	<li>Transfira o supernante para um tubo fresco de 1,5 mL no gelo, evitando o transporte do precipitado branco e nublado que se forma em cima da amostra. O supernante é agora o extrato esclarecido. NOTA: Economize 10 μL do extrato esclarecido para determinar a concentração total da proteína.</li>
	<li>Use o extrato imediatamente para os seguintes experimentos ou congele o extrato em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os extratos podem ser armazenados à temperatura ultrabaixo (-80 °C congelador ou nitrogênio líquido por ~6 meses). Extratos congelados podem ser descongelados uma vez e não podem ser refrozenados.</li>
	<li>Determine a concentração total de proteínas do extrato utilizando um kit de ensaio de concentração de proteína compatível com detergentes (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>3. Imunoprecipitação
NOTA: Todas as etapas de imunoprecipitação para a preparação do extrato devem ser realizadas no gelo ou a 4 °C. Recomenda-se o uso de 2 mg de proteína total para cada imunoprecipitação. No entanto, foram realizadas imunoprecipitações bem sucedidas com 0,8-1 mg de proteína total. Use sempre extratos de proteínas frescos ou descongelados. O protocolo a seguir é delineado para realizar imunoprecipitação a partir de 2 mg de proteína total, ou um único experimento de imunoprecipitação. A quantidade de contas e anticorpos pode ser aumentada ou diminuída em conformidade para múltiplas amostras ou se uma quantidade diferente de extrato de proteína for usada.
<ol><li>Coloque ou descongele o extrato de proteína no gelo. A amostra pode ser diluída a 10 mg/mL ou 5 mg/mL com tampão de 1x de lise gelada (ver Tabela 1).</li>
	<li>Resuspenda as contas magnéticas por inversão e transfira 150 μL da suspensão de contas de 50% em um tubo de 1,5 mL. Magnetize as contas no gelo contra uma posição magnética por 1 min ou até que a solução esteja clara. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Remova o tubo do suporte magnético e lave as contas em 1x tampão de lise usando 2 volumes (ou seja, 300 μL) de chorume de contas. Repita a lavagem 2x para um total de três lavagens.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 150 μL de tampão de lise gelada.</li>
	<li>Transfira 75 μL do chorume de contas para 2 mg de extrato de proteína e incubar a 4 °C por 1h com agitação suave. Guarde a suspensão restante do cordão um pouco no gelo para uso posterior. NOTA: Esta etapa é realizada para reduzir a ligação proteica inespecífica às contas durante a etapa de imunoprecipitação.</li>
	<li>Coloque o tubo com amostra no suporte magnético no gelo por 1 minuto ou até que as contas estejam totalmente magnetizadas e a amostra esteja clara. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mL; não perturbe as contas. Este é o lise de proteína pré-esclaro. Guarde 10% da amostra para análise de manchas ocidentais.</li>
	<li>Adicione 20 μg de anticorpo purificado de afinidade ao lise pré-esclara e incubar a 4 °C por 1h com agitação suave. NOTA: A quantidade de anticorpos utilizados para a imunoprecipitação é específica para o anticorpo e proteína e deve ser empiricamente determinada para garantir uma imunoprecipitação eficaz da proteína alvo.</li>
	<li>Adicione os 75 μL restantes da suspensão pré-lavada das contas (etapa 3.5) à mistura de anticorpos/lisesato e incubar por 1h a 4 °C com agitação suave.</li>
	<li>Coloque o tubo no suporte magnético no gelo por 1 minuto ou até que as contas estejam totalmente magnetizadas e a amostra esteja clara. Guarde o supernatante para análise de manchas ocidentais (opcional).</li>
	<li>Lave as contas contendo o imunoprecipitato 3x em 450 μL de tampão de lavagem (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloreto de potássio, 0,1% Triton X, 2 mM cloreto de magnésio, 10% glicerol, 1 mM DTT; ver Tabela 1) no gelo. NOTA: Podem ser realizadas lavagens adicionais se forem preferidas condições de lavagem mais rigorosas.</li>
	<li>Resuspenha a pelota de contas em 20 μL de 2x tampão de carregamento de gel de proteína SDS/BME (ver Tabela de Materiais) e desnaturar a 95 °C por 5 minutos antes de carregar em um gel SDS-PAGE. Alternativamente, as amostras desnaturadas podem ser armazenadas a -20 °C por vários meses. NOTA: Uma parte do imunoprecipitato de contas pode ser salva para o isolamento do RNA a jusante, se desejar.</li>
</ol>4. Detecção de manchas ocidentais de amostras de IP
<ol><li>Carregue as amostras IP no gel SDS-PAGE (ver Tabela de Materiais). Evite transferir as contas colocando os tubos IP no suporte magnético por 1 minuto antes da aspiração da amostra.</li>
	<li>Realizar a mancha ocidental15,16 e mancha deanticorpos 16 com as seguintes modificações: diluir o anticorpo ALG-117 1:500 em 5% de leite seco não gordo (NFDM); diluir o anticorpo HRPK-12 1:1.000 em 5% NFDM; e diluir o anticorpo AIN-118 1:10.000 em 5% NFDM. Anticorpos secundários (ver Tabela de Materiais) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Detecte as bandas com chemiluminescência baseada em HRP (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

C. elegans é um excelente modelo para estudar questões fundamentais em biologia celular, molecular e de desenvolvimento19. Além de seu poder como um sistema de modelo genético, C. elegans é favorável a abordagens bioquímicas, incluindo, mas não se limitando a, imunoprecipitação proteica e co-imunoprecipitação. Um obstáculo potencial na realização de experimentos de imunoprecipitação é a falta de anticorpos específicos às proteínas de interesse. Se nenhum anticorpo estiver disponível, podem ser gerados anticorpos policlonais ou monoclonais personalizados. No entanto, as recentes inovações na tecnologia de edição de genomas permitiram aos pesquisadores introduzir rapidamente mutações ou marcar genes endógenos C. elegans 20,21, facilitando estudos que desvendam as interações genéticas, funcionais e físicas entre os genes e as proteínas codificadas. Especificamente, a marcação mediada por CRISPR/Cas9 de genes C. elegans no loci endógeno reduziu a dependência de experimentos de imunoprecipitação na disponibilidade de anticorpos, tornando os experimentos de co-imunoprecipitação muito mais viáveis. C. elegans genes podem ser marcados com uma variedade de tags que vão desde tags fluorescentes como GFP ou mCherry até pequenas tags como FLAG e HA. Os anticorpos que reconhecem essas etiquetas estão prontamente disponíveis comercialmente, facilitando os estudos de interações proteína-proteína através de abordagens de imunoprecipitação.
O protocolo apresentado, delineado na Figura 1,pode ser realizado para um pequeno número de amostras ou ampliado, permitindo até 24 preparações amostrais por vez. Embora as caracterizações iniciais de interações proteína-proteína via imunoprecipitação sejam tipicamente feitas em origens do tipo selvagem em condições normais de crescimento, estudos de acompanhamento frequentemente exigem testar as interações proteína-proteína em uma variedade de origens genéticas ou em diferentes condições de crescimento. A capacidade de preparar simultaneamente vários extratos economiza tempo e, importante, garante a consistência de preparação do extrato entre as diferentes amostras. Um controle negativo é sempre necessário, com o controle ideal sendo uma mutação nula na codificação genética para a proteína imunoprecipitada de interesse (Ver Figura 3 e Figura 4, por exemplo).
Este protocolo de extrato permite a preparação rápida do extrato de proteínas a partir de amostras de C. elegans e é comparável à homogeneização à base de contas de zircônio8. A homogeneização das contas em geral pode ser dimensionada até múltiplas preparações simultâneas de amostras usando uma variedade de homogeneizadores de moinhos de contas ou equipamentos similares. Alguns homogeneizadores mais econômicos da fábrica de contas podem reduzir o número de amostras que podem ser processadas simultaneamente, no entanto. Alternativamente, o protocolo de extrato apresentado é compatível com a preparação do extrato à base de dounce, que representa uma alternativa econômica. Embora diferentes homogeneizadores de moinhos de contas não tenham sido testados, a maioria provavelmente será compatível com este protocolo de extrato de proteína, desde que a interrupção completa das amostras de C. elegans seja alcançada.
Como apresentado, este protocolo de preparação de extratos é compatível com múltiplos experimentos a jusante, incluindo imunoprecipitação proteica2 e microRNA pull-down12 e permite a coleta a jusante de componentes de proteína e RNA. Também extrai eficientemente proteínas nucleares e citoplasmáticas(Figura 2, Figura 3e Figura 4). Da mesma forma, o protocolo de imunoprecipitação apresentado permite o isolamento do RNA de imunoprecipitatos associados à proteína. Embora o protocolo de imunoprecipitação tenha sido originalmente desenvolvido para identificar os interagedores de proteínas ALG-1, o método pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer proteínas de interesse. De fato, as condições de imunoprecipitação utilizadas funcionaram igualmente bem para imunoprecipitação ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1 (Figura 4). Este protocolo é um excelente ponto de partida para a imunopurização de proteínas de ligação de RNA. Deve-se notar, no entanto, que algumas mudanças na composição do buffer podem ser necessárias para outras proteínas de interesse. As alterações podem depender das propriedades físicas e bioquímicas da proteína de interesse e devem ser implementadas caso a caso.
Uma vez que a proteína alvo (aqui, ALG-1 ou HRPK-1) é imunoprecipitada, a mancha ocidental pode ser usada para testar o co-imunoprecipitato para interagidores específicos de proteínas.
Alternativamente, o imunoprecipitato copurificado pode ser submetido à análise de espectrometria de massa para identificar todas as proteínas interativas putativas. Interações confirmadas de co-imunoprecipitação podem então ser examinadas em uma variedade de origens genéticas ou condições para identificar a possível regulação da interação específica. Por exemplo, para determinar se o HRPK-1 desempenha um papel na montagem ALG-1/AIN-1 miRISC, a coprecipitação ALG-1-AIN-1 foi avaliada tanto em um fundo tipo selvagem quanto na ausência de HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 foi considerado dispensável para interação ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Além disso, a tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9 pode ser empregada para gerar mutações de exclusão de ponto único ou domínio nas proteínas de interesse. Retestar a capacidade dos mutantes gerados de coprecipitar com seus interajadores de proteínas pode revelar quais domínios ou resíduos mediam a interação física. Tais estudos futuros podem produzir informações inestimáveis sobre o mecanismo da função e regulação da proteína. Essas abordagens, combinadas com o poder da genética C. elegans, podem fornecer insights importantes sobre os processos moleculares fundamentais que regem o desenvolvimento animal e a função celular.

Identificar as interações macromoleculares de uma proteína de interesse pode ser a chave para aprender mais sobre sua função. Experimentos de imunoprecipitação e co-imunoprecipitação podem ser usados para identificar todo o interactome de uma proteína através de abordagens proteômicas em larga escala1 ou para testar especificamente a capacidade de uma proteína de coprecipitar com um interagidor hipotético. Em C. elegans,ambos os métodos foram empregados com sucesso para aprender mais sobre a atividade de uma variedade de proteínas, incluindo aquelas que funcionam de perto com microRNAs para regular a expressão genética2,3,4. Experimentos de co-imunoprecipitação têm a vantagem de testar as interações proteína-proteína em seu ambiente celular nativo, mas a preparação do extrato pode ser desafiadora e demorada. A lise eficiente da amostra é necessária, mas deve-se tomar cuidado para minimizar a interrupção das interações proteína-proteína. Métodos como douncing5, sonication6, Balch homogenization7, e zircônia beads-homogeneization8,9 têm sido usados para preparar com sucesso extratos totais de proteínas C. elegans. Esses métodos, com exceção da homogeneização da conta de zircônia, têm limitações em termos do número de amostras que podem ser processadas simultaneamente. Apresentado é um método alternativo que pode ser facilmente dimensionado para permitir a preparação de extratos de proteínas rápidas e de alta produtividade de C. elegans seguidos de co-imunoprecipitação. Especificamente, o método pode preparar até 24 amostras por vez, reduzindo consideravelmente o tempo necessário para a preparação do extrato. Em contraste, por exemplo, douncing normalmente permite apenas uma preparação amostral por vez. Este método extrato pode ser usado para preparar extratos de qualquer estágio de desenvolvimento de C. elegans.
Descrito é um procedimento passo-a-passo para coleta de amostras de animais, preparação de extratos, imunoprecipitação e apresentação de dados de manchas ocidentais para confirmar a retirada e detecção bem sucedida da proteína co-imunoprecipitante de interesse. Para demonstrar a eficácia do protocolo, foram realizados dois experimentos de co-imunoprecipitação entre 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, um homólogo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, um recém-identificado interagedor ALG-12. ALG-1 e AIN-1 são proteínas centrais que compõem o complexo de silenciamento induzido pelo microRNA (miRISC) e a interação entre essas duas proteínas é bem estabelecida10,11. O protocolo de preparação do extrato foi eficaz no experimento de co-imunoprecipitação ALG-1-AIN-1. Este protocolo também confirmou com sucesso a interação entre a ALG-1e seu recém-identificado interager, HRPK-12 .
Em resumo, o manuscrito descreve um protocolo de preparação de extrato de C. elegans que pode ser dimensionado para processar simultaneamente 24 amostras, juntamente com um protocolo de co-imunoprecipitação que pode ser usado para identificar novas ou confirmar interações hipotéticas entre proteínas. O protocolo de preparação do extrato é compatível com uma série de experimentos a jusante, incluindo imunoprecipitaçãoproteica 2 e pulldowns microRNA12. Além disso, o protocolo de imunoprecipitação pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer duas ou mais proteínas endógenas, marcadas ou superexpressas em uma variedade de origens genéticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:989px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-664</td>
			<td style="width:213px;">STEP 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Métodos de co-imunoprecipitação são frequentemente usados para estudar interações proteína-proteína. A confirmação de interações proteína-proteínas hipotéticas ou a identificação de novas podem fornecer informações inestimáveis sobre a função de uma proteína de interesse. Alguns dos métodos tradicionais de preparação de extratos frequentemente requerem técnicas intensivas em mão-de-obra e demoradas. Aqui, um protocolo de preparação de extratos modificados usando um homogeneizador de moinho de contas e contas metálicas é descrito como uma alternativa rápida aos métodos tradicionais de preparação de proteínas. Este método de preparação do extrato é compatível com estudos de co-imunoprecipitação a jusante. Como exemplo, o método foi usado para co-imunoprecipitar com sucesso C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e dois interagidores alg-1 conhecidos: AIN-1 e HRPK-1. Este protocolo inclui descrições da coleta de amostras de animais, preparação de extratos, esclarecimento de extratos e imunoprecipitação proteica. O protocolo descrito pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer duas ou mais proteínas endógenas, marcadas endógenamente ou superexpressas em uma variedade de origens genéticas.

Este protocolo (esquematizado na Figura 1) foi utilizado com sucesso para obter extratos totais de proteínas C. elegans (Figura 2) para imunoprecipitação a jusante de várias proteínas2 (Figura 3 e Figura 4). O protocolo de homogeneizador da fábrica de contas apresentado foi comparável na extração total de proteínas aos métodos à base de dounce(Figura 2) e eficientemente extraído nuclear (COL-19::GFP(NLS) (Figura 2) e proteínas citoplasmáticas(Figura 3 e Figura 4). Várias amostras de vários tamanhos foram extraídas simultaneamente(Figura 2). As proteínas argonautas interagem com membros da família de proteínas GW182, formando os miRISCs que se ligam ao mensageiro alvo RNAs e reprimem sua expressão10. A Figura 3 mostra uma co-imunoprecipitação bem-sucedida dos componentes núcleo miRISC ALG-1 e AIN-1, consistentes com os relatórios anteriores11,17. Mais recentemente, foram feitos esforços para identificar interagidores proteicos adicionais do Argonaute ALG-13, a fim de saber mais sobre como a biogênese e a atividade do microRNA podem ser reguladas por fatores auxiliares. A proteína de ligação de RNA HRPK-1 foi identificada em imunoprecipitatos ALG-13. Esta interação foi recentemente confirmada em um experimento recíproco de imunoprecipitação HRPK-12. Os protocolos de extração e imunoprecipitação apresentados recuperaram com sucesso a ALG-1 em co-imunoprecipitatos específicos hrpk-1(Figura 4). Além disso, a interação ALG-1 -AIN-1 foi testada em uma variedade de origens genéticas e o HRPK-1 mostrou-se desnecessário para o conjunto ALG-1/AIN-1 miRISC2 (Figura 3). Figuras suplementares são fornecidas para mostrar a membrana completa sondada(Figura Suplementar 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figura 1: Esquema de fluxo de trabalho para C. elegans extraem preparação e imunoprecipitação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figura 2: Comparação de manchas ocidentais de um GFP localizado nuclear, COL-19::GFP(NLS), níveis em amostras preparadas e homogeneizadas de 250 μL e 100 μL de pelotas de vermes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figura 3: GW182 homólogo AIN-1 co-imunoprecipitates com ALG-1. Manchas ocidentais para proteínas ALG-1 e AIN-1 em imunoprecipitatos ALG-1. A co-imunoprecipitação ALG-1/AIN-1 não foi afetada pela ausência de hrpk-1. Entrada = 10% de IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figura 4: ALG-1 co-imunoprecipitatos com HRPK-1. Mancha ocidental para HRPK-1 e ALG-1 em imunoprecipitatos HRPK-1 é mostrado. Entrada = 10% de IP. * indica corrente pesada de anticorpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tampão M9 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>até 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampão de lysis 2x (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>TritonX 10%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>até 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adicione fresco:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibidor de protease sem EDTA</td>
			<td>1 comprimido</td>
		</tr>
<tr>
<td>coquetel inibidor de fosfatase 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>coquetel inibidor de fosfatase 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampão de lysis</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluir 2x tampão de lise com um volume igual de ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampão de lavagem 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>TritonX 10%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>até 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (adicionar fresco)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Receitas
Figura Suplementar 1. As membranas ocidentais investigadas completas usadas para gerar figuras 2-4 são mostradas. (A) Membrana sondada para a Figura 2. Note que a membrana foi cortada para permitir a sondagem simultânea para GFP e Tubulin, reduzindo o tamanho geral da mancha. (B) Membrana sondada para a Figura 3. (C) Membrana sondada para a Figura 3. *denota a corrente pesada de anticorpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Este método descreve um protocolo para a preparação de extratos de proteína de alto rendimento de amostras de elegans de Caenorhabditis e posterior co-imunoprecipitação.

Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.6K visualizações.  Kansas State University. Este método descreve um protocolo para a preparação de extratos de proteína de alto rendimento de amostras de elegans de Caenorhabditis e posterior co-imunoprecipitação.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Estudando estresse oxidativo causado pelo estreptococos grupo Mitis em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...