The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

1. Preparação da alimentação Bactérias NOTA: Esta seção descreve a preparação de bactérias alimentam (E. coli OP50). <ol><li> Isolar uma única colônia de E. coli estirpe OP50 a partir de um caldo de lisogenia (LB) e agar de placa inocular assepticamente em 300 ml de caldo LB autoclavado. </li><li> Permitir que a cultura inoculada a crescer durante a noite num agitador a 200 rpm e 37 ° C, até que é atingida a saturação. </li><li> Transfira a OP50 em 6 estéreis, pré-pesado de 50 ml tubos cônicos. Sedimentar as bactérias por centrifugação durante 5 min a 6000 rpm (5000 xg). </li><li> Descartar o sobrenadante e lava-se as bactérias com 50 ml de M9 estéril. Repita duas vezes. </li><li> Após a segunda lavagem remover o restante M9, assegurando que nenhum M9 é deixado no tubo. </li><li> Determinar o peso do sedimento por pesagem do tubo contendo o sedimento de bactérias e subtrair o peso do tubo de 50 ml. </li><li> Ressuspender o pellet in M9 a uma concentração de 100 mg / ml. </li><li> Guardar a solução OP50 a 4 ° C até ser utilizado para a cultura sem-fim. </li></ol> 2. Preparação de crescimento de nemátodos Médias Plates (NGM) Petri NOTA: Esta seção descreve a preparação de placas NGM Petri, que são as placas onde o C. elegans vermes são rotineiramente mantidas em laboratório. <ol><li> Autoclave o meio agar NGM. </li><li> Utilizando procedimentos de esterilização, dispensar 17 ml de solução de agar NGM em seis centímetros placas de Petri utilizando uma bomba peristáltica. NOTA: uma quantidade constante de agar nas placas reduz a necessidade de reorientar o microscópio quando se muda de uma placa para outra. </li><li> Deixar as placas à temperatura ambiente durante 2-3 dias antes da utilização para deixar o agar solidificar e permitir que o excesso de humidade se evapore. </li><li> Semente as placas NGM usando uma técnica estéril. Aplicar 1-2 gotas de OP50 cultura líquida e espalhado utilizando uma vareta de vidro. Certifique-se que nãopara espalhar o relvado bactérias todo o caminho para as extremidades das placas. </li><li> Permitir que o relvado OP50 a crescer durante 1-2 dias à temperatura ambiente antes de utilizar as placas de crescer vermes. </li></ol> 3. Elaboração de um População Worm Synchronous NOTA: O ciclo de vida de C. elegans é constituída pela fase embrionária, quatro estádios larvares (L1-L4) e na idade adulta. Esta seção descreve a preparação de uma população síncrono-idade de worms. Todos os materiais que entram em contacto com C.elegans após o tratamento de branqueamento deve ser estéril. <ol><li> Dia 1 - Preparação de Gravid Worm População <ol><li> Utilizar placas NGM em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 faminto. </li><li> Colete as larvas L1 com um verme esterilizado escolher e transferi-los para novas placas de 6 cm NGM semeado com OP50. Incubar durante cerca de 65 horas a 20 ° C até que a maioria dos vermes são adultos grávidos. Paraevitar placa superlotação e permitir que os vermes de crescer sem esgotar as bactérias, não transferir mais do que um ou dois grupos de larvas L1 para cada placa NGM fresco. </li></ol></li><li> Dia 4 - Criação de um Synchronized L1 Larvas População <ol><li> Recolha os vermes grávidas a partir das placas NGM, lavando-as com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cônico de 15 ml. </li><li> Deixe os vermes fêmeas grávidas sedimentar para o fundo do tubo de 15 ml durante aproximadamente 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme. </li><li> Transfira o pellet worm para 2-4 microtubos e adicionar 1 ml de água sanitária / solução de NaOH. Incubar durante 2-3 minutos à temperatura ambiente. Monitorar o progresso da reação, ao microscópio estereoscópico para confirmar todos os vermes estão mortos. Não lixívia mais de 5 min como os embriões poderiam morrer. </li><li> Recolha os vermes por centrifugação por 1 min a 3.000 rpm (900 xg). Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução estéril para M9neutralizar a reacção. </li><li> Lave os vermes duas vezes por centrifugação durante 1 min a 3000 rpm (900 xg). </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar a M9 até 100-200 ul. </li><li> Usando uma pipeta de pasteur de vidro adicionar uma gota do verme / M9 misturar para limpar placas NGM e incubar durante pelo menos 24 horas a 20 ° C para permitir que os embriões para eclodir. NOTA: Sem comida crescimento das larvas será interrompido na fase L1. </li></ol></li><li> Dia 5 - Criação de um Synchronized L4 Larvas População <ol><li> Recolhe-se o larvas L1 a partir das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml. </li><li> Deixe a vermes adultos mortos sedimentos para o fundo do tubo cónico de 15 mL durante aproximadamente 5 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante, em que os vermes são L1, em um novo tubo cónico de 15 ml, e precipitar os vermes por centrifugação durante 2 min a 2600 rpm (1000 xg). </li><li> Remover o sobrenadante leendo cerca de 500 ul. </li><li> Determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas. </li><li> Ajustar a concentração dos vermes para vermes 20-25 / ul e adicionar 50 ul de o sem-fim / M9 mistura para placas NGM semeados com OP50. </li><li> Incubar durante 65 horas a 15 ° C (por meio de incubação a fim-de-semana) para permitir que a população sincronizada L1 a crescer até atingirem a fase de L4. </li></ol></li></ol> 4. Exposição de Worms para Chemicals em placas de 96 poços NOTA: Esta seção descreve o uso de Pxol1 :: repórter transcricional GFP contendo C. elegans estirpe para pesquisar a indução de aneuploidia. <ol><li> Recolhe-se o larvas L4 das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml. </li><li> Deixe a L4 vermes sedimentos para o fundo doTubo de 15 ml por cerca de 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme. </li><li> Adicionar 3-5 ml de M9 e determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas de cada amostra. </li><li> Ressuspender os vermes, a uma concentração de 1.000 / ml em vermes M9. </li><li> Diluir as bactérias OP50 da seção 1 10 vezes com M9. Certifique-se que as bactérias em ressuspensão atingir a temperatura ambiente, porque temperatura mais baixa afeta o desenvolvimento worm. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, primeiro adicionar 100 ul do verme / mistura M9 (a partir do passo 4.4) e, em seguida, adicionar 400 ul das OP50 bactérias diluídas (a partir do passo 4.5) em cada poço de uma 2 ml de fundo redondo profunda placa de 96 poços. No final, cada poço terá 100 vermes em 500 ul. </li><li> Adicionar 0,5 uL de quer o produto químico de teste ou de controlo apropriado para os poços desejados, para alcançar uma concentr definitiva sugeriução de 100 pM, uma concentração utilizada em telas químicos em C. elegans 12. Expor etanol ou controlos de solvente de DMSO a uma concentração final de 0,1%. NOTA: Recomendamos a utilização de nocodazole (100 M) como controle positivo. </li><li> Selar a placa usando película adesiva. Certifique-se de selar a placa bem para evitar a contaminação cruzada entre os poços. </li><li> Enrole a placa com papel alumínio. </li><li> Transferir a placa para um agitador (170-180 rpm) de uma temperatura adequada para o período de tempo adequado (24 ou 65 horas). A temperatura da sala afecta o crescimento dos vermes; manter a temperatura a cerca de 20 ° C. </li></ol> Aquisição 5. Imagem de grávidas Worms em 384 poços Placa NOTA: Esta secção descreve o uso de um elevado teor de microscópio de imagem exposto a Pxol1 :: vermes gfp, para visualizar a expressão da GFP nos embriões no útero de hermafroditas adultos. Paracada placa de 384 poços a serem rastreados, vermes de utilizar placas de 4 x 96 poços. <ol><li> Após a exposição a substâncias químicas com o agitador, deixar a placa de 96 poços repouso durante 10-15 minutos para permitir que os vermes adultos para sedimentar para o fundo da placa. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, remover 350 ul da M9, ​​sendo muito cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa. </li><li> Lave os vermes com 1 ml de M9 e repita o passo 5.1. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, 1 ml de remover o M9, sendo vey cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, ressuspender os vermes no restante M9 e recolher 100 uL do verme / M9 mistura a partir das placas de 96 poços e carregá-lo nas cavidades de paredes pretas de / fundo transparente placa de 384 poços. Repetir o processo de utilização de vermes das placas 4 x 96 cavidades, até que todos os poços da placa de 384 poços foram carregadas. NOTA: É importante que todos os poços, para ter o mesmo volume, a fim de aumentar aeficiência e velocidade do autofoco durante o processo de aquisição de imagem. Cada poço deverá conter entre 80 a 100 vermes. </li><li> Adicionar 1 ml de levamisol (100 uM) a cada poço e deixar os vermes incubar durante aproximadamente 30 min. NOTA: Levamisol actua como um agonista do receptor de acetilcolina e imobiliza os vermes. </li><li> Transferir a placa com um alto teor de microscópio de campo amplo capaz de fornecer imagem automatizado. </li><li> Para aquisição de imagem, use uma aquisição e análise de imagem de software alto teor de acordo com as orientações do fabricante. Selecione o objetivo 4X para adquirir uma imagem por poço. </li><li> Antes de iniciar a aquisição de imagem, ajustar os parâmetros de imagem GFP para 45 ms de exposição e resolução de imagem de 2160 x 2160. </li><li> Recolher os dados como o número de vermes positivas para GFP divididos pelo número total de vermes no poço, sendo a última medida relativamente consistente entre poços. </li></ol>

<ol>
	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

O método aqui descrito constitui a primeira estratégia de grande escala para a identificação de substâncias tóxicas da linha germinal. Ele requer o uso de um transgênico GFP Pxol-1 :: GFP contendo tensão que relata fielmente a indução de aneuploidia em embriões, que é usado como um proxy para a disfunção da linha germinativa. O método envolve a sincronização cuidadosa de um C. população sem-fim elegans e exposição dos vermes aos agentes químicos em formato de 96 poços se...

Há cerca de 87.000 produtos químicos registrados para o comércio nos Estados Unidos, mas apenas um pequeno número destes foram testados quanto aos efeitos potenciais sobre a saúde 1. Daqueles que foram testados, apenas uma parte foi avaliada para efeitos de saúde reprodutiva, em parte devido à dificuldade em determinar a alteração dos eventos precoces reprodutivas em mamíferos, especialmente durante o desenvolvimento de células germinativas femininas e diferenciação. Na verdade, os primeiros eventos da meiose ocorrem durante os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário em mamíferos do sexo feminino e são, portanto, de difícil acesso e coletar em números adequados para fins de rastreio. A linha germinativa proporciona a ligação crucial entre gerações, e a sua função apropriada depende da execução precisa do programa intrincado da divisão celular e alterações cromossómicas denominado meiose. A desregulação do processo meiótico pode resultar na redução da fertilidade e da produção degametas e embriões com um número anormal de cromossomos, uma condição denominada aneuploidia. Erros de segregação cromossômica na meiose são altamente relevantes para a saúde humana. Anormalidades cromossômicas são comuns, com uma frequência de 1 em cada 150 nascidos vivos, Trissomia 21, 18 e 13, bem como X e Y erros de cromossomos, sendo os tipos mais prevalentes 2,3. Além disso, malformações congênitas, incluindo os de origem cromossômicas, são a principal causa de morte infantil em os EUA 4 A idéia de que as influências ambientais podem afetar a segregação e do comportamento cromossômico não é nova 5, mas ainda é pouco compreendida. Assim, é fundamental investigar qual dos produtos químicos introduzidos no nosso ambiente estão a interferir com a fertilidade humana, o desenvolvimento precoce e saúde reprodutiva em geral. À luz dessas limitações dos modelos de mamíferos, temos desenvolvido um ensaio de tela de alto rendimento para testar a toxicidade reprodutiva na lombriga &lt;em&gt; C. elegans. Temos mobilizou várias características importantes oferecidos por este sistema modelo genético comumente utilizadas, tais como seu pequeno tamanho, baixo custo, ciclo de reprodução curta, alta proporção de células germinativas e facilidade de manipulação 6. Os vermes podem ser cultivadas em placas de 96 poços ou em culturas líquidas de alto volume e por causa de sua transparência pode ser visualizado directamente em placas para a detecção de repórteres fluorescentes. O ensaio descrito a seguir aproveita estas características e tira vantagem de uma estirpe repórter que contém o sem-fim fluorescente Pxol-1 :: GFP para detectar perturbações da linha germinal e indução de aneuploidia embrionária. A utilização desta estirpe repórter é baseada na ocorrência rara geralmente de machos na população verme principalmente hermafroditas. Estes homens (&lt;0,2%) originam naturalmente de erro na segregação do cromossomo X 7. No entanto, como a interrupção da linha germinativa frequentemente leva a erros na segregação dos autossomose de heterochromosomes, correlaciona-se ambos com uma incidência elevada de machos do fenótipo (X missegregation), bem como a letalidade embrionária (autosome missegregation). Para detectar facilmente a indução de machos, contornando o problema da letalidade embrionária, um promotor específico do macho (Xol-1) é utilizado para conduzir a expressão da GFP em embriões precoces ainda contidos no interior do útero do sem-fim. Como tal, o aparecimento de embriões que expressam GFP é utilizado como um substituto para a presença de embriões aneuplóidicos. Este método tem sido utilizado anteriormente para identificar genes implicados na manutenção da linha germinal e meiose 8,9. Adaptado para filtragem de produtos químicos, esta estirpe é empregue numa forma de tela de alto rendimento. É importante ressaltar que a cepa relata fielmente a aneugenicity de produtos químicos e é, portanto, relevante para endpoints reprodução de mamíferos 10. O ensaio descrito aqui será particularmente útil para toxicologistas em configurações da indústria química farmacêutica e à procurapara avaliar rapidamente a toxicidade dos produtos químicos para com terminais reprodutivos. Além disso, este ensaio se alinha totalmente com as prioridades governamentais destacadas na toxicidade no st relatório 21 do século 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="975">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td style="width:129px;">Tritech</td>
			<td>T3315</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Agar</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-274</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td style="width:129px;">Corning</td>
			<td>P-DW-20-C-S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:129px;">Apex</td>
			<td>20-261</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bacto-tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1421-2</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bleach</td>
			<td style="width:129px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>AA12316-A1</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138225</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">DMSO</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>IC19018680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>EM-4455S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR 384 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1937-32EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageXpress Micro XLS System&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Levamisole hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31742</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>97061-438</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress High Content Image Acquisition &#38; Analysis Software&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Rayon Films for Biological Cultures</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>BDH0316</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:473px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 745</td>
			<td style="width:255px;">This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:129px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

A identificação da toxicidade reprodutiva das milhares de substâncias químicas presentes em nosso ambiente tem sido um dos desafios mais tentadoras no campo da saúde ambiental. Isto é devido em parte à falta de sistemas modelo que podem (1) recapitulam precisão chaves características dos processos reprodutivos e (2) fazê-lo em um meio a high-throughput forma, sem a necessidade de um elevado número de animais vertebrados. Descrevemos aqui um ensaio no nemátodo C. elegans que permite a rápida identificação de substâncias tóxicas da linha germinal por monitorização da indução de embriões aneuplóidicos. Ao fazer uso de uma linha repórter GFP, erros na segregação cromossoma resultante da interrupção da linha germinativa são facilmente visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência automatizada. Assim, o rastreio de um determinado conjunto de compostos para a sua toxicidade pode ser realizada num formato de placa de 96 a 384 poços numa questão de dias. Análise secundária de h positivoseu pode ser realizado para determinar se as anomalias cromossómicas originado meiótica perturbação ou de erros iniciais de segregação cromossoma embrionárias. Ao todo, este ensaio representa uma estratégia de primeira passagem rápida para a rápida avaliação da disfunção germline seguinte exposição a substâncias químicas.

Exposição do Pxol-1 :: GFP estirpe repórter de agentes químicos, tais como o veneno de microtúbulos Nocodazole (Figura 1) leva à indução de uma alta proporção de embriões que expressam GFP no útero de hermafroditas adultos expostos em comparação com controlo de DMSO. Os embriões GFP positivas são significativamente mais brilhantes do que a fraca fluorescência de fundo observada em outros embriões, assim como a auto-fluorescência observada no intestino dos animais. Vermes são...

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K visualizações.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Biologia do Desenvolvimento

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Estudando estresse oxidativo causado pelo estreptococos grupo Mitis em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...