O protocolo atual mostra em detalhes a liberação sub-retiniana de todos os organoides da retina em um modelo animal de grande porte, com o objetivo de desenvolver abordagens de terapia celular para degeneração retiniana. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a entrega de organoides diretamente para o tecido alvo, a retina. A técnica visa tratar condições degenerativas retinianas cegantes avançadas, como degeneração macular relacionada à idade, retinose pigmentar ou amaurose congênita de Leber.
Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Peterson Jones. Para o implante sub-retiniano dos organoides, use a tesoura de tenotomia Stevens para realizar uma cantotomia lateral de 0,5 a 1 centímetro em um gato anestesiado de jejum noturno de quatro meses de idade e coloque um espéculo de pálpebra de Barraquer de tamanho adequado na incisão para manter as pálpebras abertas com um assistente cirúrgico irrigando regularmente a córnea com BSS durante todo o procedimento. Use pinça de amarração corneana de Castroviejo 0,5 e um pequeno hemostático de mosquito para segurar suavemente a conjuntiva bulbar próxima ao limbo.
Coloque duas suturas de seda 6-0 na conjuntiva imediatamente adjacente ao limbo nas posições 4 e 8 horas para segurar o olho no olhar primário e retrair a terceira pálpebra. Aperte as extremidades das suturas com pequenos hemostáticos de mosquito para facilitar sua manipulação e coloque outra sutura na posição das 12 horas no limbo parcialmente através da espessura do limbo, tomando cuidado para não penetrar no olho. Amarre frouxamente a sutura, cortando a extremidade curta, e coloque uma sutura de permanência na conjuntiva imediatamente adjacente ao limbo na posição das 4 horas para segurar o olho e o olhar primário.
Refletir a conjuntiva bulbar entre 10 e 2 horas, e usar tesoura de tenotomia para incisar a conjuntiva a dois a três milímetros do limbo. Neutralizar a conjuntiva e limpar a cápsula de Tenon para expor a esclera nos locais de duas e 10 horas do porto de vitrectomia a três a cinco milímetros do limbo. Use paquímetros para identificar os locais de esclerotomia, evitando os grandes vasos esclerais que podem ser proeminentes no gato.
Planejando uma região de três milímetros no orifício de instrumento das 10 horas para um cirurgião destro, pré-colocar pontos de padrão cruzado de poliglactina 6-0 ou 7-0 sem amarrar nos locais das esclerotomias propostas. Uma vez que as suturas estejam no lugar, peça ao assistente que segure as suturas de 12 horas para ajudar a manter o globo na posição e use pinça de Castroviejo 0,12 milímetro para segurar o tecido próximo ao local da esclerotomia. Usa um trocarte para introduzir uma porta de vitrectomia de calibre 23 através da esclera nas posições de 2 e 10 horas inclinada em direção ao nervo óptico para evitar o contato com a lente, e usa pinças de amarração para empurrar suavemente a porta de irrigação para determinar se as pontas podem ser visualizadas dentro do vítreo.
Peça ao assistente que coloque uma lente de vitrectomia irrigadora Machemer na córnea para permitir a visualização do segmento posterior do olho, e um cortador de sonda de vitrectomia de calibre 23 através da porta do instrumento para realizar uma vitrectomia parcial por núcleo. Em seguida, introduza a agulha de uma seringa de um mililitro contendo um mililitro de solução de triancinolona na porta do instrumento e injete de 250 a 500 microlitros da suspensão de cristal. Quando a solução tiver sido entregue, avance a sonda de vitrectomia através da porta do instrumento para perto da cabeça do nervo óptico com a porta voltada para longe da superfície da retina.
Use alto vácuo para ajudar a desprender a face vítrea da retina, insira o injetor através da porta do instrumento em direção à superfície da retina e extruda a ponta da cânula. Pressione suavemente a ponta da superfície da retina e peça ao assistente que dê um leve empurrão rápido no êmbolo da seringa para iniciar o descolamento de retina, reduzindo a pressão de injeção para permitir um aumento lento do descolamento de retina até que o tamanho desejado seja alcançado. Use uma cânula de calibre 41 do injetor para aumentar ligeiramente o descolamento até que a tesoura de retina possa ser introduzida e remova a porta escleral das 10 horas.
Em seguida, use uma faca de fenda reta de 2.850 milímetros orientada em direção ao nervo óptico para evitar tocar a lente para ampliar a esclerotomia neste local. Faça a retinotomia na bolha longe do nervo óptico para evitar danificar as fibras nervosas da retina originárias da região transplantada e evite cortar os principais vasos da retina para reduzir o risco de hemorragia. Para implantar os organoides, insira um capilar de vidro carregado de organoides através da esclerotomia alargada em direção ao local da retinotomia e use a ponta do capilar para abrir levemente a retinotomia para permitir o acesso à abertura da bolsa sub-retiniana.
Peça ao assistente que pressione lentamente o êmbolo do injetor novamente para injetar os organoides na bolsa sub-retiniana. A BSS deve proceder organoides, os órgãos, e liberar a retinotomia aberta. Quando todos os organoides tiverem sido entregues, deixe o capilar de vidro no lugar por alguns segundos antes de remover lentamente o capilar do olho, tomando cuidado para evitar qualquer liberação repentina de líquido.
Quando o capilar tiver sido removido, fechar a esclerotomia com a sutura pré-colocada em padrão cruzado. Peça ao assistente que retire a porta de infusão, amarre rapidamente a sutura da esclerotomia e feche a peritomia com as suturas de poliglactina em um padrão contínuo simples. Fechar a cantotomia lateral com fio de poliglactina 6-0 e suturas cutâneas de figura oito para realizar o canto lateral e utilizar suturas simples de pele interrompida para fechar o restante da ferida.
Em seguida, administrar o coquetel pós-cirúrgico apropriado de esteroides e antibióticos. A carga organoide retiniana derivada de células-tronco pluripotentes humanas pode ser confirmada dentro da cânula de vidro do dispositivo de injeção e durante a cirurgia por visualização direta. A presença dos organoides no espaço sub-retiniano pode ser confirmada no pós-operatório por exame oftalmológico e fundoscopia.
Antes da eutanásia, a oftalmoscopia confocal a laser de varredura e a tomografia de coerência óptica de domínio espectral também podem ser realizadas para avaliar a posição dos organoides. Essas técnicas podem ser usadas para demonstrar a persistência de organoides da retina no espaço sub-retiniano entre a retina neural e o epitélio pigmentado da retina do olho receptor. Análises histológicas e imuno-histoquímicas podem ser usadas para ilustrar a sobrevivência dos gráficos xenogênicos no espaço sub-retiniano de um grande olho em um animal imunossuprimido.
Somente aqueles especializados em cirurgia vitreorretiniana, como oftalmologistas veterinários treinados ou cirurgiões vitreorretinianos familiarizados com as diferenças de espécie no olho do gato em comparação com o olho humano devem realizar este procedimento. A técnica apresentada neste vídeo deve ser aplicável a outros modelos animais de grande porte que são utilizados para traduzir técnicas cirúrgicas vitreorretinianas para as clínicas.
