Agradecemos a Roberta Migliore pela assistência técnica. A pesquisa que levou a esses resultados recebeu financiamento da Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) no âmbito do projeto IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Para todos os pacientes inscritos, o sangue periférico e o suco pancreático foram coletados no momento da cirurgia, de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Instituição. Todos os pacientes foram incluídos no estudo após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, incluindo coleta de espécimes biológicos e dados clínicos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Instituição (protocolo número ICH-595, aprovação emitida em maio de 2009). Os procedimentos envolvendo camundongos e seus cuidados foram conformes às Diretrizes da UE e Institucionais (protocolo ID 121/2016-PR).
1. Isolamento do suco pancreático
NOTA: A retirada do suco pancreático é executada no contexto de um procedimento aberto de ressecção pancreática (por exemplo, pancreaticoduodenectomia, pancreatectomia total, pancreatectomia distal) por uma equipe de cirurgiões pancreáticos especializados.
<ol><li>Seleção de pacientes<ol><li>Considere para o procedimento qualquer paciente agendado para uma ressecção pancreática aberta.</li>
		<li>Confirme a inclusão se o tamanho do ducto pancreático principal for considerado suficiente para permitir a recuperação do suco pancreático. O limite mínimo de diâmetro do ducto pancreático principal é considerado de 2 mm na TC com contraste.</li>
	</ol></li>
	<li>Estudo pré-operatório do ducto pancreático na tomografia computadorizada (TC) com contraste para ajudar no planejamento da recuperação do suco pancreático<ol><li>Localizar tridimensionalmente o ducto pancreático principal dentro da glândula ao nível do colo pancreático: meça a distância do ducto pancreático principal da margem pancreática anterior, superior e inferior em lâminas transversais e renderizações coronais e sagitais. Uma vez na sala de cirurgia, use essas medidas para se aproximar do local correto onde perfurar o pâncreas para canular o ducto de Wirsung e recuperar o suco pancreático.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de material<ol><li>Material estéril: Abra o envelope estéril de uma agulha de 25 G e uma seringa de 3 mL e posicione-os no campo estéril com a cooperação da enfermeira de esfoliação.</li>
		<li>Material não estéril: Mantenha um tubo de ensaio a vácuo K2EDTA de 3 mL pronto na sala de cirurgia para o armazenamento do fluido.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do paciente<ol><li>Posicione o paciente na cama da sala de cirurgia. Induzir anestesia geral mista, usando Remifentanil, Sevorane e Rocurônio, em seguida, intubar e começar a ventilar o paciente. Posicione o paciente em decúbito dorsal com o braço direito dobrado ao corpo e o braço esquerdo abduzido a 90° graus preso em uma armboard.</li>
		<li>Desinfetar a pele do abdômen no local da incisão. Crie e mantenha um campo estéril no abdômen cobrindo o paciente.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimento cirúrgico<ol><li>Realize uma incisão subcostal e obtenha acesso à cavidade abdominal. Posicione uma retração abdominal de Rochard para exposição de órgãos.</li>
		<li>Expor e mobilizar o pâncreas através da manobra de Kocher, abertura do ligamento gastrocólico, incisão do tecido retroperitoneal ao longo da borda superior e inferior do pâncreas criando um plano de dissecção entre o colo pancreático e a veia mesentérica superior localizada posteriormente.</li>
		<li>Uma vez que o pâncreas é mobilizado e exposto, prossiga para a retirada do suco pancreático antes da secção do pescoço pancreático.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificação e localização do ducto pancreático<ol><li>Estime a localização do ducto pancreático usando a medição feita na imagem e, em seguida, palpar a superfície anterior do pâncreas para identificar sua localização precisa.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleção de suco pancreático<ol><li>Segure a cabeça pancreática e o duodeno por baixo e eleve-o com a mão esquerda, marcando a localização do ducto pancreático com o primeiro dígito.</li>
		<li>Segure com a mão direita da seringa de 3 ml com a agulha de 25 G montada.</li>
		<li>Use a mão direita para inserir a agulha no pâncreas apenas distal ao polegar esquerdo. Decidir a profundidade de penetração e o grau de inclinação da agulha com base em medidas pré-operatórias e na percepção de ter penetrado na parede do duto.</li>
		<li>Retire o suco com a seringa. Se não for possível recuperar o suco, realoque a agulha nas quatro direções tentando canular o ducto pancreático.</li>
		<li>Uma vez que o suco pancreático é recuperado, mova-o para fora do campo estéril e transfira-o para o tubo de ensaio a vácuo K2EDTA de 3 mL. Manter a 4 °C até que a amostra seja transferida para o laboratório e proceder a um processamento adicional o mais cedo possível. NOTA: O volume de suco pancreático que pode ser recuperado com este procedimento varia muito, variando aproximadamente de 0,2 mL a 3 mL em nossa experiência. A quantidade de suco recuperada é altamente dependente do paciente: a dimensão do ducto de Wirsung e o estado funcional do pâncreas (funcionamento versus glândula atrófica). Em nossa experiência, não há nenhum expediente que possa ser usado para aumentar a quantidade de suco pancreático recuperado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Processamento de suco pancreático
<ol><li>Centrifugar o sumo pancreático a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C para remover quaisquer células ou detritos. NOTA: O suco pancreático deve ser de cor clara e transparente antes da centrifugação. A contaminação do sangue durante a cirurgia às vezes pode ocorrer, fazendo com que a amostra pareça mais escura e de cor mais vermelha. Considere excluir essas amostras de análises posteriores.</li>
	<li>Recuperar o sobrenadante, alíquota e conservar a -80 °C até novas análises.</li>
</ol>3. Indução de tumores subcutâneos
NOTA: As linhagens celulares murinas Panc02 e DT6606 foram obtidas do Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Milão, Itália) e do Prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Torino, Itália), respectivamente, conforme descrito anteriormente12.
<ol><li>Crescimento de células tumorais<ol><li>Cultura de células Panc02 e DT6606 em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 2mM L-Glutamina e 1% de antibiótico penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>Descongele as células congeladas 1-2 semanas antes da injeção do tumor, de acordo com a taxa de crescimento da linhagem celular.</li>
		<li>Cultivar células a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições estéreis.</li>
		<li>Descole as células com solução de tripsina/EDTA a 0,025% por 5 min a 37 °C quando atingirem 80% de confluência e eliminarem a tripsina por centrifugação. NOTA: DT6606 são células primárias, não imortalizadas, derivadas do rato LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, e não devem ser passadas mais de 3 vezes antes da injeção in vivo para manter as suas características originais. Recomenda-se descongelar as células DT6606 7-10 dias antes da injeção.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeção de células tumorais in vivo
	<ol><li>Tripsinize as células (ver passo 3.1.4) e lave-as uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Elimine o PBS por centrifugação e ressuspenda as células no PBS fresco antes de contar.</li>
		<li>Conte as células e ressuscite-as em PBS a uma concentração de 0,5-1 x 107 células/mL para ter uma concentração final de 0,5-1 x 106 células/100 μL para injetar em cada rato. Prepare as células em excesso. Manter as células a 4 °C ou sobre gelo até ao final do procedimento.</li>
		<li>Agrupar os animais (camundongos C57BL/6J fêmeas de 8 semanas de idade) em diferentes gaiolas de acordo com diferentes linhagens celulares ou tratamentos.</li>
		<li>Restrinja os animais manualmente e anestesia-os utilizando uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ou de acordo com procedimentos aprovados localmente.</li>
		<li>Raspe o local da injeção, geralmente um flanco acima de uma perna, com um barbeador elétrico e limpe cuidadosamente o local da injeção com álcool.</li>
		<li>Pipetar para cima e para baixo a suspensão celular com uma seringa de 1 ml, removendo quaisquer bolhas de ar movendo o êmbolo para cima e para baixo. Ligue uma agulha de 25 G à seringa e empurre o êmbolo para cima até que a suspensão celular atinja a abertura da agulha.</li>
		<li>Aperte a pele do flanco com pinças de ponta plana e insira cuidadosamente a agulha na base da dobra cutânea entre a pinça sem perfurar a cavidade peritoneal ou a musculatura. Para verificar a posição correta da agulha, tente mover suavemente a ponta da agulha lateralmente sob a pele. A agulha deve mover-se livremente.</li>
		<li>Injete lentamente 100 μL de suspensão celular (contendo 0,5-1 x 106 células), prenda suavemente o local da injeção por alguns segundos e retire lentamente a agulha sem qualquer movimento lateral.</li>
		<li>Devolva o rato de volta à sua gaiola e monitorize a recuperação da anestesia.</li>
		<li>Verifique o crescimento do tumor usando um paquímetro por 3-4 semanas. Eutanasiar os animais quando os tumores atingem aproximadamente 0,5-1 cm3 usando CO2 ou de acordo com procedimentos aprovados localmente.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Isolamento do líquido intersticial tumoral (TIF)
<ol><li>Excisão de tumores subcutâneos<ol><li>Bloqueie os membros dos animais com fita adesiva de papel e limpe a pele com álcool. Corte a pele aberta no abdômen para separá-la do peritônio e vá até os membros. Excise o tumor crescido sob a pele do flanco com a ajuda de tesouras, grampos e, eventualmente, um bisturi.</li>
		<li>Pese o tumor e mantenha-o em um tubo limpo no gelo até seguir o isolamento do TIF.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de TIF por centrifugação<ol><li>Corte o tumor ao meio, lave as duas partes rapidamente em PBS e apague-as suavemente em papel de filtro para remover o excesso de PBS. Realize essas etapas o mais rápido possível para evitar a evaporação do tumor.</li>
		<li>Transfira imediatamente o tumor para um filtro de células de nylon de 20 μm afixado sobre um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 400 x g durante 10 min a 4 °C. NOTA: Esta centrifugação de baixa velocidade preserva a integridade celular evitando a contaminação do TIF pelo compartimento intracelular. O vazamento de conteúdo intracelular pode ser testado em aplicações a jusante, por exemplo, avaliando a presença de proteínas de limpeza intracelular, como proteínas ribossomais25.</li>
		<li>Recuperar o TIF do fundo do tubo, eventualmente alíquotá-lo e congelá-lo imediatamente em gelo seco e armazenar a -80 °C até uma análise mais aprofundada. Opcional: Com base na análise proteômica a jusante a ser realizada, diluir a amostra em PBS com um coquetel inibidor de protease para evitar a degradação de moléculas específicas. NOTA: Dependendo da composição do tumor, em alguns casos tumores muito pequenos não produzem nenhum fluido.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento do TIF por eluição<ol><li>Corte o tumor em pedaços pequenos (≈1-3 mm3) com uma tesoura ou um bisturi e enxágue cuidadosamente com PBS frio. NOTA: Nesta etapa, é muito importante trabalhar rápido e executar o mínimo de manipulação para evitar danos celulares.</li>
		<li>Transfira os pedaços do tumor para um tubo de 1,5 mL e adicione 500 μL de PBS com um coquetel inibidor de protease para evitar a degradação dos analitos. Incubar durante 1 hora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Recupere o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 1 000 x g durante 5 minutos a 4 °C para remover quaisquer células da amostra.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar novamente a 2.000 x g durante 8 min a 4 °C.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar novamente a 20.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para remover quaisquer detritos. Recupere o sobrenadante. Aliquotar e congelar imediatamente a amostra de TIF em gelo seco e conservar a -80 °C até nova análise.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste estudo, descrevemos a técnica de coleta intraoperatória de suco pancreático, uma biópsia de fluidos em grande parte inexplorada. Recentemente, mostramos que o suco pancreático pode ser explorado como fonte de marcadores metabólicos da doença12. A análise metabolômica em outras biópsias líquidas, como sangue 5,6,7, urina8 e saliva9, mostrou r...

O adenocarcinoma ductal pancreático (ACPD) é um dos tumores mais agressivos, e logo se tornará a segunda principal causa de morte 1,2,3. É conhecida por seu microambiente imunossupressor e por sua falta de resposta aos protocolos de imunoterapia4. Atualmente, a ressecção cirúrgica ainda é a única opção curativa para a ACPD, mas há uma alta frequência de recidivas precoces e complicações pós-cirúrgicas. A falta de sintomas específicos até um estágio avançado não permite um diagnóstico precoce, contribuindo para os prazos da doença. Além disso, a sobreposição de sintomas entre o PDAC e outras patologias pancreáticas benignas pode dificultar a obtenção de um diagnóstico rápido e confiável com as estratégias diagnósticas atuais. A identificação de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas poderia facilitar o processo de tomada de decisão cirúrgica e melhorar o perfil do paciente.
Resultados promissores na descoberta de biomarcadores têm sido alcançados utilizando fluidos corporais de fácil acesso, como sangue 5,6,7, urina8, saliva 9 e suco pancreático10,11,12. Muitos estudos exploraram abordagens "ômicas" abrangentes, como técnicas genômicas, proteômicas e metabolômicas, para identificar moléculas ou assinaturas candidatas que poderiam discriminar entre PDAC e outras aflições pancreáticas benignas. Recentemente, demonstramos que o suco pancreático, um fluido corporal relativamente inexplorado, pode ser utilizado para identificar assinaturas metabólicas de pacientes com perfis clínicos distintos12. O suco pancreático é um fluido rico em proteínas, que acumula o secretoma das células ductais pancreáticas e flui para o ducto pancreático principal e, em seguida, para o ducto biliar comum principal. Devido à sua proximidade com o pâncreas, pode ser fortemente afetada por perturbações microambientais induzidas pela massa tumoral (Figura 1) e, portanto, mais informativa do que o sangue ou a urina, ou o perfil baseado em tecidos. Vários estudos têm explorado o potencial do suco pancreático para identificar novos biomarcadores de doença usando várias abordagens, incluindo análise citológica 13, análise proteômica realizada por espectrometria de massa14,15, avaliação de marcadores genéticos e epigenéticos como mutações K-ras e p53 16,17, alterações na metilação do DNA 18 e miRNAs 19 . Tecnicamente, o suco pancreático pode ser coletado no intraoperatório ou com procedimentos minimamente invasivos, como ultrassonografia endoscópica, colangiopancreatografia retrógrada ou por coleta endoscópica de secreção de suco duodenal20. Ainda não está claro até que ponto a composição do suco pancreático é afetada pela técnica de coleta utilizada. Descrevemos aqui o procedimento de coleta intraoperatória e mostramos que o suco pancreático pode representar uma fonte preciosa de biomarcadores PDAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática da coleção de suco pancreático. (A) Representação esquemática que descreve a secreção de suco pancreático no ducto pancreático e sua coleta durante a cirurgia. A inserção mostra um close-up do microambiente tumoral: o suco pancreático coleta moléculas liberadas por células tumorais e estromais nos ductos pancreáticos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A coleta de suco pancreático em modelos genéticos e ortotópicos de camundongos de PDAC seria apreciada na perspectiva de explorar esse biofluido em estudos mecanicistas pré-clínicos; no entanto, esse procedimento pode ser tecnicamente muito desafiador e inviável para modelos mais simples, como tumores subcutâneos. Por esse motivo, identificamos o líquido intersticial tumoral (TIF) como uma fonte alternativa ao suco pancreático, por sua característica semelhante de atuar como um indicador de perturbações circundantes. O líquido intersticial (FI) é o líquido extracelular, encontrado fora dos vasos sanguíneos e linfáticos, que banha as células teciduais21. A composição do FI é afetada tanto pela circulação sanguínea para o órgão quanto pela secreção local; de fato, as células circundantes produzem e secretam ativamente proteínas no FI21. O interstício reflete as alterações microambientais dos tecidos circundantes e, portanto, pode representar uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores em vários contextos patológicos, como tumores. A alta concentração de proteínas secretadas localmente no TIF pode ser utilizada para identificar moléculas candidatas a serem testadas como biomarcadores prognósticos ou diagnósticos no plasma22,23,24. Vários estudos comprovaram que o TIF é uma amostra adequada para abordagens proteômicas de alto rendimento, como técnicas de espectrometria de massa 23,24,25, bem como abordagens ELISA multiplex 26 e perfil de microRNA 27.
Diversas abordagens têm sido propostas para o isolamento do FI em tumores, que podem ser amplamente categorizados como in vivo (ultrafiltração capilar 28,29,30,31 e microdiálise 32,33,34,35) e métodos ex vivo (centrifugação tecidual 22,36,37,38 e eluição tecidual 39,40,41,42). Essas técnicas têm sido revisadas em detalhesextensivos 43,44. A escolha do método adequado deverá ter em conta questões como as análises e aplicações a jusante e o volume recuperado. Recentemente, utilizamos essa abordagem como prova de princípio para demonstrar a diferente atividade metabólica de tumores de duas linhagens celulares de adenocarcinoma pancreático murino12. Com base na literatura24,38, optou-se por utilizar o método de centrifugação de baixa velocidade para evitar a quebra celular e a diluição do conteúdo intracelular. Tanto a quantidade de glicose quanto o lactato no TIF refletiram as diferentes características glicolíticas das duas linhagens celulares diferentes. Aqui descrevemos detalhadamente o protocolo para os dois métodos mais utilizados para o isolamento de TIF: centrifugação tecidual e eluição tecidual (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática dos métodos de isolamento do líquido intersticial tumoral. Ilustração esquemática das técnicas descritas detalhadamente no protocolo, nomeadamente centrifugação tecidual (A) e eluição tecidual (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>GR616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL K2EDTA vacutainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.20.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>9000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Microtech</td>
			<td>MG10432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tipped forceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>06.00.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>34044100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>02.04.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 1x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraglutamine 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E/U1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of proximal fluids to investigate the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma

O adenocarcinoma pancreático (PDAC) é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer e logo se tornará a segunda. Há uma necessidade urgente de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas para auxiliar o diagnóstico diferencial pré-operatório e o perfil do paciente. O suco pancreático é um fluido corporal relativamente inexplorado, que, devido à sua proximidade com o local do tumor, reflete mudanças no tecido circundante. Aqui descrevemos detalhadamente o procedimento de coleta intraoperatória. Infelizmente, traduzir a coleta de suco pancreático para modelos murinos de PDAC, para realizar estudos mecanicistas, é tecnicamente muito desafiador. O líquido intersticial tumoral (TIF) é o fluido extracelular, fora do sangue e do plasma, que banha as células tumorais e estromais. Da mesma forma que o suco pancreático, por sua propriedade de coletar e concentrar moléculas que são encontradas diluídas no plasma, o TIF pode ser explorado como um indicador de alterações microambientais e como uma valiosa fonte de biomarcadores associados à doença. Como o TIF não é facilmente acessível, várias técnicas têm sido propostas para o seu isolamento. Descrevemos aqui dois métodos simples e tecnicamente pouco exigentes para o seu isolamento: centrifugação tecidual e eluição tecidual.

Seguimos o procedimento descrito acima para obtenção de suco pancreático de pacientes com PCAC (n=31) e outras aflições pancreáticas benignas (não PDAC, n=9), incluindo pancreatite (n=2), tumores papilar-ampola (n=4), tumores neuroendócrinos (n=2), neoplasia mucinosa papilar intraductal (NMPI; n=1)12. As amostras de suco pancreático foram então submetidas à análise metabolômica por ressonância magnética nuclear (1H-NMR)12. Ao filtrar o...

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Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

O suco pancreático é uma fonte preciosa de biomarcadores para o câncer de pâncreas humano. Descrevemos aqui um método para o procedimento de coleta intraoperatória. Para superar o desafio de adotar esse procedimento em modelos murinos, sugerimos uma amostra alternativa, o líquido intersticial tumoral, e descrevemos aqui dois protocolos para seu isolamento.

Isolamento de Fluidos Proximais para Investigar o Microambiente Tumoral do Adenocarcinoma Pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

isolation-proximal-fluids-to-investigate-tumor-microenvironment

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.1K visualizações.  Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS. O suco pancreático é uma fonte preciosa de biomarcadores para o câncer de pâncreas humano. Descrevemos aqui um método para o procedimento de coleta intraoperatória. Para superar o desafio de adotar esse procedimento em modelos murinos, sugerimos uma amostra alternativa, o líquido intersticial tumoral, e descrevemos aqui dois protocolos para seu isolamento.

Vídeo: Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, in the case that the KD of the protein of interest has a lethal effect on cells or the anticipated effect of the KD is time-dependent, unconditional KD methods are not appropriate. Conditional systems are more suitable in these cases and have been the subject of much interest. These include Ecdysone-inducible overexpression systems, Cytochrome P-450 induction system1, and the tetracycline regulated gene expression systems. 
The tetracycline regulated gene expression system enables reversible control over protein expression by induction of shRNA expression in the presence of tetracycline. In this protocol, we present an experimental design using functional Tet-ON system in human cancer cell lines for conditional regulation of gene expression. We then demonstrate the use of this system in the study of tumor cell-monocyte interaction.

This protocol serves as a scheme for setting up a functional Tet-ON system in cancer cell lines and its subsequent use, in particular for studying the role of tumor cell-derived proteins in recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment.

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Pesquisa do câncer

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the 3-dimensional (3D) modeling of this disease have been described. Patient-derived organoid (PDO) models can be isolated from both surgical specimens as well as small biopsies and form rapidly in culture. Importantly, organoid models preserve the pathogenic genetic alterations detected in the patient&#39;s tumor and are predictive of the patient&#39;s treatment response, thus enabling translational studies. Here, we provide comprehensive protocols for adapting tissue culture workflow to study 3D, matrix embedded, organoid models. We detail methods and considerations for isolating and propagating primary PDAC organoids. Furthermore, we describe how bespoke organoid media is prepared and quality controlled in the laboratory. Finally, we describe assays for downstream characterization of the organoid models such as isolation of nucleic acids (DNA and RNA), and drug testing. Importantly we provide critical considerations for implementing organoid methodology in a research laboratory.

Patient-derived organoid cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma are a rapidly established 3-dimensional model that represent epithelial tumor cell compartments with high fidelity, enabling translational research into this lethal malignancy. Here, we provide detailed methods to establish and propagate organoids as well as to perform relevant biological assays using these models.

Isolamento e caracterização de modelos organóides de adenocarcinoma ductatopansa pâncreas derivados do paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role of CAFs in the tumor microenvironment can be helpful for understanding the functional importance of fibroblasts, fibroblasts from different tissues, and specific genetic factors in fibroblasts. Mouse models are essential for understanding the contributors to tumor growth and progression in an in vivo context. Here, a protocol in which cancer cells are mixed with fibroblasts and introduced into mice to develop tumors is provided. Tumor sizes over time and final tumor weights are determined and compared among groups. The protocol described can provide more insight into the functional role of CAFs in tumor growth and progression.

A protocol to co-inject cancer cells and fibroblasts and monitor tumor growth over time is provided. This protocol can be used to understand the molecular basis for the role of fibroblasts as regulators of tumor growth.

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell populations. To characterize proteome-level variation and tumor heterogeneity at scale, high-throughput methods are needed to selectively isolate discrete cellular populations in solid tumor malignancies. This protocol describes a high-throughput workflow, enabled by artificial intelligence (AI), that segments images of hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained, thin tissue sections into pathology-confirmed regions of interest for selective harvest of histology-resolved cell populations using laser microdissection (LMD). This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of regions denoting cell populations of interest, annotated using digital image software, directly to laser microscopes, thus enabling more facile collections. Successful implementation of this workflow was performed, demonstrating the utility of this harmonized method to selectively harvest tumor cell populations from the TME for quantitative, multiplexed proteomic analysis by high-resolution mass spectrometry. This strategy fully integrates with routine histopathology review, leveraging digital image analysis to support enrichment of cellular populations of interest and is fully generalizable, enabling harmonized harvests of cell populations from the TME for multiomic analyses.

This protocol describes a high-throughput workflow for artificial intelligence-driven segmentation of pathology-confirmed regions of interest from stained, thin tissue section images for enrichment of histology-resolved cell populations using laser microdissection. This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of demarcations denoting cell populations of interest directly to laser microscopes.

Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features of a unique and convenient model system. As highly proliferative cells are more susceptible to radiation-induced DNA damage, zebrafish embryos are a front-line in vivo model in radiation research. In addition, this model projects the effect of radiation and different drugs within a short time, along with major biological events and associated responses. Several cancer studies have used zebrafish, and this protocol is based on the use of radiation modifiers in the context of radiotherapy and cancer. This method can be readily used to validate the effects of different drugs on irradiated and control (non-irradiated) embryos, thus identifying drugs as radio sensitizing or protective drugs. Although this methodology is used in most drug screening experiments, the details of the experiment and the toxicity assessment with the background of X-ray radiation exposure are limited or only briefly addressed, making it difficult to perform. This protocol addresses this issue and discusses the procedure and toxicity evaluation with a detailed illustration. The procedure describes a simple approach for using zebrafish embryos for radiation studies and radiation-based drug screening with much reliability and reproducibility.

The zebrafish has recently been exploited as a model to validate potential radiation modifiers. The present protocol describes the detailed steps to use zebrafish embryos for radiation-based screening experiments and some observational approaches to evaluate the effect of different treatments and radiation.

Larvas de zebrafish como modelo para avaliar potenciais radiossensibilizadores ou protetores

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Mapeando a paisagem imune do tumor: um protocolo de análise IHC multiplex aprofundado

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

Autor em destaque: Desbloqueando insights sobre o cenário de células imunológicas de tumores

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.

Análise Imuno-Histoquímica Multiplex da Paisagem Espacial de Células Imunes do Microambiente Tumoral

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...