A análise de células populacionais laterais é um dos métodos comumente utilizados para isolar e identificar células-tronco cancerígenas de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Este método pode contribuir para uma melhor compreensão do efeito de genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares sobre as propriedades de tronco das células tumorais.
Muitos fatores podem influenciar o percentual de células de SP nesta análise, por isso é fundamental explorar as condições adequadas antes do experimento formal. Células tumorais de sementes em uma placa de seis poços, e incubar-as em uma incubadora Celsius de 37 graus fornecida com 5% de dióxido de carbono. Quando a densidade celular atinge cerca de 90% aspirar o meio de cultura, e lavar as células duas vezes com três mililitros de PBS.
Em seguida, adicione 500 microliters de 0,25% trypsin-EDTA a cada poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por um a três minutos. Bata suavemente na placa para desprender as células, adicione três mililitros de PBS suplementados com 2% de FBS em cada poço, e pipete as células para cima e para baixo três a cinco vezes para dispersar os aglomerados celulares. Examine a suspensão da célula sob o microscópio.
Se houver aglomerados de células, passe a suspensão através de um filtro de 70 micrômetros. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifuá-las a 200 vezes g por cinco minutos. Remova o supernasce, e resuspense as células em três mililitros de PBS suplementados com 2%FBS, esbofiando as células para cima e para baixo três a cinco vezes para misturar.
Conte células sob o microscópio usando um hemótmetro, e dilui-as em PBS complementadas com 2%FPS para uma concentração final de uma vez 10 para as seis células por mililitro. Prepare dois cinco mililitros, poliestireno, tubos de teste de fundo redondo, e adicione um mililitro da suspensão celular a cada tubo. Rotule um tubo como tubo de ensaio e o outro como um tubo de controle bloqueador.
Prepare uma solução de bloqueador diluindo-a à concentração apropriada. Adicione-o ao tubo de controle do bloqueador e misture bem, depois incubar o tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos. Agite o tubo a cada 10 minutos.
Prepare uma solução de Hoechst 33342 diluindo-a para a concentração apropriada. Adicione-o ao tubo de ensaio e ao tubo de controle bloqueador separadamente e misture bem, em seguida, incubar os tubos a 37 graus Celsius por 60 minutos. Agite os tubos a cada 10 minutos.
Após a incubação, centrifugar as células por cinco minutos a 200 vezes g e quatro graus Celsius, em seguida, aspirar cuidadosamente o supernante. Resuspend as células em cada tubo com um mililitro de PBS gelado suplementado com 2%FBS, em seguida, pipeta as células para cima e para baixo para misturar. Adicione um microliter de iodeto de propídio de um mililículo por mililitro, ou PI, a cada tubo e misture.
Clique na guia Parâmetros no software do citômetro de fluxo. Primeiro, escolha os parâmetros de FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI, respectivamente. Em segundo lugar, escolha a escala logarítmica para o parâmetro PI.
Finalmente, escolha escalas de área e largura para os parâmetros FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI, respectivamente. Execute as células do tubo de ensaio primeiro, em seguida, execute as células do tubo de controle bloqueador usando as mesmas tensões e portões. Coletar de 20 a 100.000 eventos de cada amostra para analisar o percentual de células de SP.
Este método foi utilizado para detectar a proporção de células de SP na linha de células cancerígenas de mama humana MDA-MB-231. O gráfico de pontos de FSC-A versus PI-A mostrou uma população de células mortas, detritos celulares e a população principal de células negativas do PI, que foi submetida a análises posteriores. Uma única população celular fechada a partir do gráfico de pontos de FSC-A versus FSC-W e o gráfico de pontos de SSC-A versus SSC-W foi usado para analisar a proporção de células de SP, que foi de cerca de 0,9% em células não tratadas e cerca de 0,09% em células tratadas com reserpina.
Diferentes concentrações de coloração de Hoechst 33342 foram testadas em células MDA-MB-435, e foi determinado que dois microgramas por mililitro foram ideais para análise de SP. Baixas concentrações dificultaram a distinção das células de SP de outras populações, enquanto altas concentrações fizeram com que as células de SP desaparecessem. Verapamil e reserpine foram testados para determinar o bloqueador adequado para as células MDA-MB-435.
Cerca de 0,4% das células expeliram o corante após o tratamento de verapamil, mas a proporção caiu para cerca de 0,1% após o tratamento de reserpine, demonstrando que a reserpina é um bloqueador mais adequado para esta linha celular. Este protocolo também foi utilizado para determinar a proporção de células de SP em células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 tratadas com colivelina ativadora STAT3 e em células cancerígenas de mama humanas T47D tratadas com inibidor FRA1 SKLB816. Este ensaio fornece pistas para o efeito regulatório da sinalização de caminhos sobre as características das células-tronco do câncer e facilita a descoberta de novos mecanismos, que podem, em última análise, orientar a terapia-alvo dos tumores.
