Reconhecemos o apoio do Conselho de Bolsas Chinesa (CSC) ao J.Z. and Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC). NL) para P.t.D.

1. Análise da fosforilação SMAD2 induzida por TGF-β usando manchas ocidentais
NOTA: As células mcf10A-ras de mama humana pré-maligna foram usadas como exemplo para investigar respostas de sinalização TGF-β33. Em princípio, os métodos descritos abaixo também são aplicáveis a outras linhas celulares com resposta à β TGF.
<ol><li>Cultura a linha de células epiteliais mamárias MCF10A-Ras a 37 °C no meio modificado da Águia (DMEM)/F12 de Dulbecco contendo L-glutamina com 5% de soro de cavalo, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), insulina 10 mg/mL, 100 ng/mL enterotoxina, 0,5 mg/mL hidrocortisona e 1:100 penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).</li>
	<li>Trippsinize células MCF10A-Ras com 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA por 1 minuto e conte células viáveis usando um contador de células.</li>
	<li>Células de sementes em placas de 6 poços a uma densidade de 5×105 células/bem.</li>
	<li>Após o crescimento noturno, trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% de albumina de soro bovino livre de ácido graxo (BSA) por 1 hora, e depois remova o meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS).</li>
	<li>Células frias em placas de 6 poços no gelo e adicionam 150 μL de amortecedor de precipitação imunológica de rádio pré-cozido (RIPA) tampão de lise (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% desoxicação de sódio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 e coquetel inibidor de mini protease recém-adicionado). Deixe a lise continuar no gelo por 10 minutos.</li>
	<li>Raspe as células aderentes do prato usando um raspador de células plásticas, em seguida, transfira suavemente a suspensão da célula para um tubo de microcentrifuge pré-cozido.</li>
	<li>Centrifugar a célula lysate por 10 minutos a 150 força centrífuga(x g) a 4 °C e transfira o supernante para um tubo de microcentrifuuge fresco de 1,5 mL.</li>
	<li>Meça a concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteína compatível com detergente (DC).</li>
	<li>Carregue 30 μg de proteína de cada amostra em um gel de gel de polifamese de sulfato de sulfato de sódio de 10% de sódio (SDS-PAGE) e execute o gel a uma tensão de 100 V por 1,5-2 horas.</li>
	<li>Transfira as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinida de 45 μm (PVDF) a uma tensão de 110 V por 1-1,5 horas.</li>
	<li>Transfira a membrana PVDF para um recipiente apropriado com o lado da proteína (o lado que estava voltado para o gel) para cima, e enxágue brevemente a membrana em água destilada.</li>
	<li>Descarte a água, adicione a solução Ponceau S e coloque a membrana em uma plataforma de balanço por 1-2 minutos.</li>
	<li>Descalgue a membrana com água destilada enxaguando-a rapidamente e depois lavando-a por 1 minuto.</li>
	<li>Em seguida, coloque a membrana PVDF em uma caixa de luz, e tire uma foto para verificar se há cargas totais de proteínas iguais.</li>
	<li>Lave a membrana com soro fisiológico tris-tampão com Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) até que não haja coloração visível.</li>
	<li>Coloque a membrana no tampão de bloqueio (5% de leite desnatado na solução TBST) e incuba-a por 1 hora à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a membrana duas vezes com TBST.</li>
	<li>Incubar a membrana com anticorpos primários contra fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, caseiro 34), total SMAD2/3 1:1000 e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1:1000), durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave a membrana duas vezes com TBST e incuba a membrana com um anticorpo secundário contra coelho ou rato (1:5000) por 2 horas.</li>
	<li>Incubar a membrana PVDF com substrato ECL ocidental por 30 segundos e detectar o sinal usando um sistema de imagem.</li>
	<li>Repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.</li>
</ol>2. Análise das respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas pelo TGF-β
<ol><li>Realize o ensaio de repórter transcricional SMAD3/SMAD4 dependente da12-luciferase.<ol>
<li>Cultura e experimentpsinize células MCF10A-Ras como descrito no Passo 1. Células de sementes em placas de 24 poços a5×10 4 células/bem e permitem que as células aderam durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte à semeadura, cotransfeito as células em cada poço com 100 ng do TGF-β/SMAD3-indutível (CAGA)12 repórter transcricional de luciferase construem35 e 80 ng da construção de expressão β-galactosidase usando polietilenimina (PEI). A transfecção de β-galactosidase é usada para normalizar diferenças na eficiência de transfecção entre diferentes poços. Criar todos os grupos experimentais em triplicado.</li>
		<li>Após 24 horas de incubação, as células de fome com glicose DMEM sem soro e, 6 horas depois, adicionam TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) como controle de veículo para as células.</li>
		<li>Depois de mais 24 horas de incubação, lave as células duas vezes com PBS pré-armado.</li>
		<li>Adicione 120 μL/bem 1× tampão de lise e agite suavemente a placa a 4 °C por 20 minutos.</li>
		<li>Transfira 30 μL de lise para cada poço de uma microplacão de ensaio branco de 96 poços para medir a atividade da luciferase usando um luminômetro.</li>
		<li>Transfira 50 μL de lise para cada poço de uma placa transparente de 96 poços para medir β-galactosidase.</li>
		<li>Normalize a atividade luciferase para a atividade β-galactosidase e repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise a expressão de genes-alvo TGF-β usando reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR).<ol>
<li>Cultura e experimentpsinize células MCF10A-Ras como descrito no Passo 1. Células de sementes em placas de 6 poços a5×10 5 células/bem e permitem que as células aderam durante a noite.</li>
		<li>Trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) por 6 horas e, em seguida, lave as células duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
		<li>Isole o RNA total usando um kit de isolamento de RNA.</li>
		<li>Determine a concentração de RNA com um NanoDrop e realize a síntese de cDNA com 1 μg de RNA usando um kit de síntese cDNA de primeira linha.</li>
		<li>Use um sistema de detecção pcr em tempo real em tempo real para executar o PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) com cDNA diluído dez vezes em uma mistura de reação de 10 μL que inclui primers humanos específicos para frente e para trás para GAPDH (para normalização), SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1, um gene de destino TGF-β/SMAD), SMAD7 (gene alvo TGF-β/SMAD) e qPCR Master Mix. Criar todos os grupos experimentais em triplicado. NOTA: As sequências de primer usadas para detectar genes humanos de destino no qRT-PCR estão listadas na Tabela 1.</li>
		<li>Use as seguintes condições de reação qPCR: inicialização, 95 °C por 3 minutos; denaturação, 95 °C por 10 segundos; ressaring, 60 °C por 30 segundos; e extensão, 80 °C por 10 segundos; denaturação, ressarem e extensão são repetidas 40 vezes.</li>
		<li>Repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análise do EMT induzido por β TGF
<ol><li>Analise a expressão dos marcadores EMT no nível da proteína usando manchas ocidentais. NOTA: A análise do EMT induzido por β TGF é mostrada usando células epiteliais NMuMG do mouse como exemplo36,37.<ol>
<li>Cultura NMuMG células a 37 °C em MEMEM-high glicose média suplementada com soro bovino fetal de 10% e 1:100 Pen-Strep. Use métodos descritos no Passo 1 para isolamento e detecção de proteínas. NOTA: Os seguintes anticorpos são usados neste experimento: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Caracol, 1:1000; Lesma, 1:1000; Tubulin, 1:1000 (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise a expressão dos marcadores EMT no nível mRNA usando PCR quantitativo em tempo real, conforme descrito na Etapa 2.2. NOTA: Todos os primers do mouse usados para qRT-PCR, incluindo CDH1 (codificação da proteína E-cadherin), SNAILe ZEB2 (Figura 3) estão listados na Tabela 1.</li>
	<li>Analise o processo EMT usando imunofluorescência indireta e coloração direta de fluorescência.<ol>
<li>Coloração indireta de imunofluorescência de E-cadherin<ol>
<li>Coloque tampas de vidro quadrada de 18 mm estéreis em placas de 6 poços (uma tampa por poço).</li>
			<li>Semente 1×105 células NMuMG com 2 mL de DMEM completo por placa de 6 poços e permitem que as células aderam durante a noite.</li>
			<li>Mova suavemente as tampas com células aderentes para uma nova placa de 6 poços e adicione 2 mL de cultura média aos poços.</li>
			<li>Trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) por 2 dias.</li>
			<li>Remova o meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de PBS pré-armado.</li>
			<li>Fixar as células adicionando 1 mL de paraformaldeído de 4% e incubando por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
			<li>Permeabilize as células fixas com 0,1% Triton X-100 por 10 minutos em temperatura ambiente e lave as células duas vezes com PBS.</li>
			<li>Bloqueie as células com 5% de BSA em PBS por 1 hora em temperatura ambiente e lave as células duas vezes com PBS.</li>
			<li>Adicione o anticorpo primário contra e-cadherina (diluído 1:1000 em PBS) ao topo de cada deslizamento de cobertura e incubar por 1 hora à temperatura ambiente.</li>
			<li>Remova o anticorpo primário e lave o deslizamento com PBS três vezes.</li>
			<li>Adicione o anticorpo secundário Alexa Fluor 555 (diluído 1:500 em PBS) ao topo de cada tampa e incubar por 1 hora à temperatura ambiente enquanto cobre com papel alumínio para proteger da luz.</li>
			<li>Remova o anticorpo secundário e lave o deslizamento com PBS três vezes.</li>
			<li>Monte o deslizamento (células voltadas para baixo) em lâminas de vidro usando meio de montagem com 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e armazene os slides montados em uma caixa a 4 °C, protegido da luz.</li>
			<li>Observe a coloração com microscopia confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloração de fluorescência direta de fisomante (F)-actin.<ol>
<li>Prepare amostras seguindo as etapas 3.3.1.1. para 3.3.1.9.</li>
			<li>Manche as células adicionando Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) por 1 hora à temperatura ambiente no escuro para visualizar o fistomante actin (F-actin).</li>
			<li>Lave as células três vezes com PBS.</li>
			<li>Monte a tampa em lâminas de vidro usando meio de montagem com DAPI e tire imagens com microscopia confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A sinalização TGF-β/SMAD desempenha um papel fundamental na progressão do câncer de mama, pois pode promover a invasão e a metástase celular do câncer de mama induzindo o EMT7. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho lógico para investigar a sinalização iniciada pelo TGF β desde a ativação SMAD induzida por receptores até respostas transcricionais e biológicas mediadas pelo SMAD. Começamos descrevendo a análise da fosforilação SMAD2, continuamos com respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas pelo TGF-β e expressão de marcadores emIT nos níveis genéticos e proteicos para analisar a resposta de sinalização TGF-β/SMAD, e finalmente examinou o EMT induzido pelo TGF β. Utilizamos o repórter transcricional12-luciferase contendo caixas derivadas do promotor PAI-1, para monitorar a atividade da via de sinalização TGF-β/SMAD35. Esta construção de repórter requer SMAD3 e SMAD4 para ativação. Estudos anteriores mostraram que o knockdown do SMAD4 atenuado a atividade12-luciferase induzida por TGF β 437. Além do ensaio do repórter, determinar o status de fosforilação de SMADs endógenos, incluindo SMAD2 e SMAD3, é outra maneira de investigar a resposta de sinalização TGF-β. De fato, outros membros da família TGF-β, como o fator de crescimento e diferenciação (GDF)-8/myostatina e GDF-9, também transduzem sinais via proteínaS SMAD2/3, engajando o TβRI42,43,44. Além do repórter12-luciferase, vários repórteres semelhantes têm sido usados para detectar a ativação da sinalização de TGF-β. Por exemplo, um repórter transcricional (SBE)4-Lux com elementos de resposta derivados do promotor junb pode ser eficientemente induzido por TGF-β, ativações e BMPs45.
Manchas ocidentais e qPCR foram usados para analisar o EMT induzido pelo TGF-β, que são métodos clássicos para investigar a expressão de marcadores epiteliais (ou seja, E-cadherin) e marcadores mesenquimais (ou seja, N-cadherin, Caracol, Lesma e Zeb2). Também foram realizadas colorações indiretas de imunofluorescência de E-cadherin e coloração direta de fluorescência de F-actin. Esses ensaios validaram ainda mais o fenótipo mesenquimal das células após o tratamento de TGF-β. A limitação da coloração da imunofluorescência é que as células precisam ser fixadas antes da incubação com anticorpos e imagens, e é difícil investigar mudanças na expressão do marcador DET em células vivas. Recentemente, o projeto de linhas celulares de repórteres emT, como adenocarcinoma-vimentin-RFP, tornou possível monitorar a transformação de células epiteliais para células mesenquimais em tempo real através da expressão de vísquia fluorescente vermelha (RFP) marcada. Esta plataforma poderia ser utilizada para triagem de medicamentos e desenvolvimento de novas drogas46. O corante LifeAct, um peptídeo de 17 aminoácidos, que pode manchar estruturas F-actin em células vivas, está se tornando uma ferramenta valiosa para visualizar o citoesqueleto actin em tempo real sem interferir nos processos celulares47. Neste estudo, foram utilizados dois inibidores de pequenas moléculas, SB431542 e GW788388, para validar seu efeito inibidor na sinalização de β TGF e no EMT induzido pelo TGF-β. Notavelmente, GW788388 inibe potentemente a atividade TβRI e TβRII, enquanto o SB431542 tem um efeito inibidor apenas no TβRI (e ALK4 e ALK7). Estudos anteriores revelaram que o GW788388 é mais potente in vivo do que o SB43154240. Além da inibição do EMT, a GW788388 reduziu a expressão de marcadores de fibrose no rim, e a administração oral de GW788388 em camundongos diabéticos diminuiu significativamente a glomerulopatia25,48.
O EMT desempenha um papel essencial na promoção da plasticidade celular do câncer e resulta na resistência a medicamentos e metástase 49. Portanto, o direcionamento de células derivadas do EMT com drogas citotóxica específicas50 ou induzindo a redifferentição através da transição mesenquimal-epitelial (MET)51 foi proposto como uma abordagem para superar a metástase celular do câncer e a resistência à terapia. No entanto, o MET contribui para a proliferação de células cancerígenas disseminadas em órgãos distantes52, o que pode ser contraproducente ao usar a reversão terapêutica do EMT. Recentemente, um novo estudo relatou uma abordagem de transdiferenciação terapêutica, visando diretamente as células cancerígenas de mama derivadas do EMT para diferenciação em adipócitos30. O estudo de Ishay-Ronen et. al.30 usaram células cancerígenas epiteliais de murina Py2T que haviam sido submetidas a uma transição para células mesenquimais em resposta ao tratamento de longo prazo com TGF-β. Eles demonstraram que rosiglitazone em combinação com inibidores MEK aumentou a diferenciação epitelial e a adipogênese. No entanto, descobrimos que a rosiglitazone por si só era suficiente para induzir a transdiferenteção de células murinas py2T mesenquimais em adipócitos.
Em resumo, os métodos utilizados neste estudo forneceram um fluxo de trabalho lógico para investigar a sinalização de β TGF e o EMT induzido pelo TGF-β. Os dois inibidores, SB431542 e GW788388, podem bloquear respostas induzidas pelo TGF-β e EMT. Além disso, também demonstramos que a rosiglitazone sozinha induz a adipogênese em certas células de câncer de mama mesenquimais induzidas por TGF β. Embora tenhamos usado apenas várias linhas de células cancerígenas de mama para investigar respostas de β TGF, os métodos descritos aqui poderiam ser extrapolados para outras células (câncer). Aqui, usamos várias concentrações de β TGF para induzir respostas celulares. Na maioria dos tipos de células, o TGF-β exerce sua atividade biológica na faixa de concentração de 0,01-10 ng/mL53 e induz a sinalização em um padrão de dose-resposta. Nas células endoteliais primárias, incluindo células endoteliais aórticas bovinas, TGF-β induziu a expressão substancial de SMAD2 fosforilado a 0,025 ng/mL, atingiu o máximo de 0,25 ng/mL, e permaneceu neste nível em resposta a concentrações mais elevadas53. Em nosso estudo, utilizamos uma alta concentração de TGF-β (5 ng/mL) em células MCF10A-Ras para o ensaio de repórter transcricional para obter respostas fortes. A fosforilação SMAD2 e a expressão genética alvo podem ser induzidas pelo TGF-β em uma dose baixa; assim, utilizamos 2,5 ng/mL TGF-β para tratar células. No entanto, a concentração de trabalho mais adequada depende do tipo celular e dos efeitos estimados. Para determinar a melhor concentração de TGF-β, recomenda-se tratar as células com diferentes doses (de baixo a alto).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

A citocina transformadora fator de crescimento-β (TGF-β) é o protótipo de um grande grupo de polipeptídeos regulatórios estrutural e funcionalmente relacionados, incluindo TGF-βs (ou seja, TGF-β1, -β2 e -β3), proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) e ativações1,2. Todas essas citocinas desempenham papéis importantes no desenvolvimento embrionário e na manutenção da homeostase tecidual e órgão3. A desregulamentação incorreta do TGF-β pode levar a uma grande variedade de doenças, incluindo o câncer4,5. O TGF-β desempenha um papel complexo e duplo na progressão do câncer: nas células epiteliais normais e pré-malignas, o TGF-β se comporta como um supressor de tumor, inibindo a proliferação e induzindo apoptose6,7; no entanto, no estágio final da progressão do tumor, quando as respostas citostáticas são bloqueadas pela ativação de oncogenes ou perda de genes supressores tumorais, O TGF-β atua como um potencializador de tumores promovendo a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em células cancerosas, permitindo assim a invasão de células cancerígenas e metástases, agindo sobre células no microambiente tumoral e estimulando a angiogênese e a evasão imunológica8,9,10.
O TGF-β é secretado como uma molécula precursora inativa contendo o terminal de carboxy-terminal maduro TGF-β e peptídeo associado à latência (LAP)11. Este pequeno complexo pode ser covalentemente ligado por proteína latente de ligação TGF-β (LTBP)12. A liberação de TGF-β maduros pode ser mediada pela ação de proteases específicas que cortam LAP ou pelo puxão mecânico de LAP em um processo dependente de integrin13,14. Além do LTBP, a Glicoproteína A repetições predominantes (GARP) é altamente expressa na superfície das células T regulatórias (Tregs) e desempenha um papel semelhante ao LTBP na regulação da ativação do TGF-β15,16. O GARP liga-se diretamente ao TGF-β latente através de linkagem de dissulfeto e associação não covalente. A ativação do TGF-β do complexo GARP/TGF-β requer integrins17. TGF-β maduro se liga aos receptores de quinase serina/threonina β TGF, ou seja, receptores TGF-β tipo I (TβRI) e TGF-β tipo II (TβRII)receptores 18 para iniciar a sinalização. A vinculação do TGF-β à TβRII promove o recrutamento de TβRI e a formação de um complexo heteromérico. Posteriormente, o TβRI é fosfoilado por TβRII quinase em resíduos de serina e threonina em um breve motivo glicina e serino-rico (GS), resultando em sua ativação19,20. Após a ativação, o TβRI ativado recruta e fosfolam seus substratos: os dois SMADs específicos do receptor (R-SMADs) que incluem SMAD2 e SMAD3(Figura 1). Os R-SMADs compartilham uma estrutura global semelhante com dois dos chamados domínios de homologia louca, MH1 e MH2, que são separados por uma região de linker rica em proline(Figura 2). O motivo de ligação de DNA dentro do domínio MH1 do SMAD3 não é conservado entre SMAD2 e SMAD3, e o SMAD2 não pode ligar diretamente o DNA por causa de duas inserções em seu domínio MH1 (exon 3 e L1). SMAD2 e SMAD3 podem ser ativados pela fosforilação do motivo SSXS em seu C-termini (Figura 2). O SMAD2/3 fosforilado forma complexos heteroméricos com um mediador SMAD comum, SMAD4, que se transloca para o núcleo para modular a transcrição de genes-alvo(Figura 1)7,21. Essa via de sinalização canônica do SMAD é precisamente regulada e gera respostas celulares e teciduais específicas, como a regulação do destino celular e da metástase celular tumoral e a invasão22. Além da sinalização TGF-β-SMAD, as vias de sinalização não-SMAD também podem ser ativadas diretamente por receptores para regular as respostas celulares a jusante23.
Durante a progressão do tumor, a ativação de vias dependentes de SMAD induzidas por TGF β e vias independentes de SMAD são necessárias para a indução do EMT. O EMT é um processo reversível no qual as células tumorais diferem de um fenótipo epitelial, que está associado à perda de contatos celulares-células e diminuição da polaridade apical-basal, a um fenótipo mesenquimal com motilidade aprimorada e capacidade de invasão24. O EMT é caracterizado pelo aumento da expressão de proteínas marcadores mesenquimais, incluindo N-cadherin, vimentina, Zeb2 e Snail1/2, e a regulação concomitante de marcadores epiteliais, como E-cadherin e β-catenin(Figura 3)25. No entanto, a transição de um epitelial para um estado mesenquimal é muitas vezes incompleta, e as células ganham características epiteliais e mesenquimais (E/M). Um artigo recente da Associação Internacional emIT propôs descrever o processo de células submetidas a estados fenotípicos intermediários de E/M como plasticidade epitelial-mesenquimal (EMP)26. Essa plasticidade refere-se a EMT parcial, um status híbrido de E/M, um estado emt metast, um contínuo EMT e um espectro EMT26. Durante o EMT, as células tumorais ganham propriedades de células-tronco cancerosas (CSC) e se tornam mais resistentes à apoptose induzida pelo descolamento27. Enquanto o EMT é responsável pela aquisição de um fenótipo invasivo em células tumorais primárias e impulsiona a progressão do câncer, em contraste, a transição mesenquimal-epitelial (MET) tem mostrado desempenhar um papel importante no crescimento das células tumorais disseminadas em locais metastáticos distantes28,29. Um estudo recente demonstrou que as células cancerígenas de mama derivadas do EMT podem ser transdiferenciadas em adipócitos, o que pode oferecer uma oportunidade para inibir a metástase e superar a resistência terapêutica em células tumorais e câncer recaído30. Devido ao importante papel da sinalização TGF-β na ativação do EMT na carcinogênese mamária, apresentamos protocolos detalhados para a mancha ocidental, um ensaio de repórter transcricional luciferase, reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) e imunofluorescência para a investigação de sinalização TGF-β, EMT induzido por TGF-β e a transdiferenciação de células tumorais de epiteliais mamárias hídrinas derivadas do EMT em adipóstos. Essas técnicas são as ferramentas analíticas mais utilizadas no campo da biologia celular. qRT-PCR é usado para detectar, caracterizar e quantificar os níveis de expressão mRNA de forma quantitativa. Em comparação com o PCR quantitativo (qPCR), uma técnica alternativa, a transcrição reversa (RT)-PCR pode ser usada para determinar a expressão mRNA de forma semi-quantitativa31,32. A mancha ocidental é usada para examinar níveis específicos de proteína em uma determinada amostra de lise celular com vantagens de sensibilidade e especificidade, de forma semi-quantitativa. Assim, apresentamos um fluxo de trabalho sistemático para analisar mudanças da expressão genética à expressão proteica para ajudar a investigar a sinalização TGF-β que também pode ser aplicada a outras vias de sinalização.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm-side square glass coverslips</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Slug antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SMAD2/3 antibody</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>610842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>A600X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>BIOKE&#180;</td>
			<td>740955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk</td>
			<td>Campina: Elk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>17001402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2030-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

Transformar o fator de crescimento β (TGF-β) é um fator multifuncional secreto que desempenha um papel fundamental na comunicação intercelular. Perturbações da sinalização de β TGF podem levar ao câncer de mama. TGF-β provoca seus efeitos na proliferação e diferenciação através de receptores TGF-β tipo I e tipo II da superfície celular específica (ou seja, TβRI e TβRII) que contêm um domínio de quinase serina/threonina intrínseca. Após a formação do complexo heteromérico induzido pelo TGF-β, o TβRI ativado provoca a sinalização intracelular por fosforilando SMAD2 e SMAD3. Estes SMADs ativados formam complexos heteroméricos com SMAD4 para regular genes alvo específicos, incluindo o inibidor de ativação de plasminogen 1 (PAI-1, codificado pelo gene SERPINE1). A indução da transição epitelial-mesenquimal (EMT) permite que células cancerígenas epiteliais no local primário ou durante a colonização em locais distantes obtenham um fenótipo invasivo e impulsionem a progressão do tumor. TGF-β atua como um potente indutor da invasão do câncer de mama dirigindo o EMT. Aqui, descrevemos métodos sistemáticos para investigar a sinalização de TGF-β e as respostas emt usando células epiteliais de MCF10A-RAS (M2) e células epiteliais NMuMG do mouse como exemplos. Descrevemos métodos para determinar a fosforilação SMAD2 induzida pelo TGF-β por mancha ocidental, atividade transcricional dependente de SMAD3/SMAD4 usando atividade de repórter luciferase e expressão genética alvo SERPINE1 por reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR). Além disso, os métodos são descritos para examinar o EMT induzido pelo TGF-β, medindo alterações na morfologia, expressão do marcador epitelial e mesenquimal, coloração de actina de fisomante e coloração de imunofluorescência de E-cadherin. Duas pequenas moléculas seletivas inibidores de quinase receptora TGF-β, GW788388 e SB431542, foram usados para bloquear a fosforilação SMAD2 induzida pelo T β GF, genes-alvo e alterações na expressão do marcador EMT. Além disso, descrevemos a transdiferenteação das células tumorais epiteliais de mamina mesenquimal Py2T em adipócitos. Métodos para examinar a sinalização induzida pelo TGF-β e o EMT no câncer de mama podem contribuir para novas abordagens terapêuticas para o câncer de mama.

Análise da sinalização de TGF-β O passo chave na sinalização TGF-β é a fosforilação dos dois resíduos de serina terminal mais carboxy no motivo SSXS(Figura 2) por TβRI quinase38,39. Para investigar as respostas de sinalização do TGF-β, realizamos manchas ocidentais de SMAD2 fosforilado. Nas células de mama humana pré-maligna MCF10A-Ras, a fosforilação de SMAD2 aumentou significativamente em resposta à estimulação de β TGF por 1 hora, enquanto a expressão do total de SMAD2/3 não foi afetada pelo tratamento de β TGF(Figura 4A). Usando o ensaio de repórter transcricional CAGA-luc induzido pelo TGF β/4, descobrimos que o TGF-β induziu notavelmente o repórter da luciferase na linha de células MCF10A-Ras em comparação com células não tratadas(Figura 4B). Além disso, observamos que os alvos genéticos transcricionais bem caracterizados de TGF-β incluindo SMAD7 e SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1), foram altamente expressos em células MCF10A-Ras tratadas pelo T β GF(Figura 4C).
Análise do EMT induzido por β TGF Avaliamos o EMT induzido pelo TGF β com vários métodos, como alterações morfológicas, a expressão de marcadores EMT nos níveis de mRNA e proteína e a coloração da imunofluorescência dos marcadores EMT36. As células epiteliais NMuMG tratadas com TGF-β por 1 e 2 dias mudaram de uma morfologia epitelial clássica para uma morfologia mesenquimal em forma de fuso, como mostrado pela microscopia de contraste de fase(Figura 5A). Consistente com as alterações morfológicas, observamos que o tratamento TGF-β levou a um aumento na expressão proteica de marcadores mesenquimais, incluindo N-cadherin, Caracol e Lesma37 (Figura 5B). Em contraste, a E-cadherina, um marcador epitelial, foi regulada em células NMuMG após 2 dias de tratamento de TGF-β(Figura 5B). Além disso, realizamos reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) para investigar a expressão genética dos marcadores EMT. O CDH1 (codificação da proteína E-cadherin) foi significativamente diminuído, enquanto marcadores mesenquimais como caracol e homeobox de dedo de zinco E-box-binding 2 (ZEB2) foram significativamente aumentados após a estimulação de TGF-β em células NMuMG em comparação com células não tratadas(Figura 5C). O EMT induzido por TGF-β em células NMuMG foi confirmado ainda pela coloração da imunofluorescência da e-cadherina. Após a estimulação TGF-β por 2 dias, as células NMuMG expressaram menos e-cadherina do que as células do grupo controle não induzido, conforme analisado pela microscopia confocal(Figura 5D). Além disso, as células NMuMG na presença de TGF-β formaram mais fibras de estresse actin, como mostra a microscopia confocal (Figura 5E).
SB431542 e GW788388 inibem sinalização TGF-β e EMT induzido por β TGF SB431542 é um inibidor competitivo da ATP do domínio quinase do TβRI, também chamado de quinase activina semelhante a receptor 5 (ALK5), enquanto GW788388 inibe a atividade de quinase TβRI e TβRII. Ambos os inibidores podem inibir a sinalização do receptor TGF-β40. Assim, tratamos células NMuMG com diferentes concentrações de GW788388 na presença de TGF-β por 1 hora. Como esperado, GW788388 inibiu a fosforilação SMAD2 induzida por TGF β de forma dependente de dose(Figura 6A). Além disso, a fosforilação mediada por TGF-β de SMAD2 foi bloqueada pelo tratamento SB431542(Figura 6A). O SMAD2/3 fosforilado forma um complexo heteromérico com SMAD4 e se transloca para o núcleo para modular a transcrição dos genes-alvo. Por isso, investigamos a translocação de células SMAD2/3 em NMuMG por coloração de imunofluorescência de SMAD2/3. Os dados demonstraram que tanto o SB431542 quanto o GW788388 inibiram significativamente a translocação nuclear induzida pelo TGF-β e o acúmulo de células SMAD2/3 em células NMuMG(Figura 6B). Além disso, os efeitos inibitórios de SB431542 e GW788388 também foram observados nos níveis de expressão mRNA de importantes genes-alvo TGF-β envolvidos no EMT, incluindo PAI-1, SNAIL, E-cadherin e Fibronectin (Figura 6C). Esses dados sugeriram que o SB431542 e o GW788388 bloquearam a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF-β.
Análise da transdiferenteção de células mesenquimais de câncer de mama em adipócitos O EMT desempenha um papel vital no aumento da plasticidade celular nos cânceres e resulta no desenvolvimento da resistência terapêutica. A plasticidade celular cancerígena pode ser diretamente direcionada e inibida com uma abordagem trans-diferenciação, como a adipogênese forçada30. Utilizamos células cancerígenas de mama de py2T, que eram derivadas da glândula mamária de um vírus mamário de camundongos vírus-polioma médio tumor-antígeno (MMTV-PyMT) transgênico, como um modelo celular de plasticidade celular induzida pelo EMT. Com base em um protocolo estabelecido41,tratamos células cancerígenas de mama py2T derivadas do EMT com a droga anti-diabética rosiglitazone por 10 dias para induzir adipogênese. A adipogênese foi avaliada pela visualização de gotículas lipídicas utilizando manchas vermelhas de óleo O. As células de gordura foram prontamente detectadas em células cancerígenas de mama py2T tratadas com rosiglitazone(Figura 7),que demonstraram que o tratamento apenas com rosiglitazone é suficiente para promover a transdiferenciação de células cancerígenas de mama derivadas do EMT em adipócitos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Figura 1: Sinalização TGF-β/SMAD. A sinalização TGF-β inicia-se com a vinculação de TGF-β ao receptor TGF-β tipo II (TβRII), uma quinase constitutivamente ativa, que fosforila TGF-β receptor tipo I (TβRI). Em seguida, ativado TβRI kinase fosforilatos SMAD2/3. Um peptídeo contendo o motivo SSXS de SMAD2 com dois resíduos de serina terminal carboxy foi usado para obter antisera policlonal reconhecendo fosforr-SMAD2 (p-SMAD2). Portanto, a análise da expressão p-SMAD2 por manchas ocidentais pode ser usada para determinar a ativação da via de sinalização TGF-β. O SMAD2/3 fosforilado pode formar complexos heteroméricos com SMAD4, que então se translocam para o núcleo para modular respostas transcricionais. O ensaio de repórter12-luciferase e o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para a expressão mRNA de genes-alvo TGF-β, como SMAD7 e SERPINE1 (codificação de proteína PAI-1), podem ser usados para analisar respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas por TGF-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Figura 2: Estrutura esquemática de R-SMADs (SMAD2 e SMAD3). Os domínios MH1 (azul) e MH2 (amarelo) são conservados entre R-SMADs, mas a região do linker (cinza) não é conservada. O domínio MH1 do SMAD3 abriga um motivo de ligação de DNA, enquanto o SMAD2 não pode ligar diretamente o DNA, por causa de uma inserção (exon 3) em seu domínio MH1. O domínio MH2 media a oligomerização do SMAD, interação com receptores TGF-β e vinculação de proteínas e está envolvido na regulação transcricional. SMAD2 e SMAD3 podem ser ativados pela fosforilação do motivo SSXS (em vermelho) em seu termini C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Figura 3: Emt induzido por β TGF. Durante a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β (EMT), as células sofrem perda de epiteliais e aquisição de características mesenquimais com maior motilidade celular e capacidade de invasão. A indução do EMT leva à expressão de marcadores mesenquimais como N-cadherin, Zeb2 e Snail1/2, bem como a baixa regulação de marcadores epiteliais, incluindo E-cadherin, β-catenin e claudin-1. A perda acumulada ou o ganho das características epiteliais/mesenquimais (E/M) faz com que uma célula entre em estados intermediários de forma reversível. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Figura 4: Respostas de sinalização TGF-β em células MCF10A-Ras. ( A )Ascélulas MCF10A-Ras foram tratadas com ou sem TGF-β (2,5 ng/mL) por 1 hora, e as células foram imunovaladas para SMAD2 fosforilado (p-SMAD2), total SMAD2/3 e GAPDH (como controle de carga). O marcador de tamanho é mostrado à direita. Contra: Grupo de controle sem tratamento TGF-β. (B) Análise da atividade transcritória TGF-β (5 ng/mL) utilizando o repórter transcricional12-luciferase (LUC) dependente de SMAD3-SMAD4 nas células MCF10A-Ras. Os valores são normalizados para atividade β-galactosidase (βGal). Os dados são expressos como a média ± s.d,n = 3. Teste t do aluno, ***P ≤ 0,001(C)qRT-PCR análise dos genes-alvo TGF-β SMAD7 e SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1) em células MCF10A-Ras tratadas com TGF-β (2,5 ng/mL) por 6 horas. GAPDH foi usado como controle interno. Os dados são expressos como a média ± s.d,n = 3. Teste do aluno, ***P ≤ 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Figura 5: EMT induzido por β TGF em células NMuMG. (A) Morfologia das células NMuMG tratadas com TGF-β (2,5 ng/mL) por 1 ou 2 dias. Na presença de TGF-β, as células NMuMG transdiferenciadas em um fenótipo mesenquimal. Barra de escala = 150 μm (B) As células NMuMG foram tratadas com ou sem TGF-β (5 ng/mL) por 2 dias, e os marcadores EMT foram analisados por manchas ocidentais. O marcador de tamanho é como indicado à direita. Contra: Grupo de controle sem tratamento TGF-β. (C) Análise da expressão genética dos marcadores EMT(CDH1 (codificação da proteína E-cadherin), SNAIL e ZEB2) em células NMuMG tratadas por 2 dias com TGF-β (5 ng/mL). GAPDH foi usado como controle interno. Os resultados são expressos como a média ± s.d., n = 3. Teste t do aluno, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) As células NMuMG foram manchadas por imunofluorescência para detectar a expressão do marcador epitelial E-cadherin (vermelho) após tgf-β (2,5 ng/mL) tratamento por 2 dias. Os núcleos foram contra-identificados com DAPI (azul). As imagens foram capturadas com microscopia confocal. Barra de escala = 50 μm(E) As células NMuMG foram manchadas com fluoresceína-fhalloidina (verde) para visualizar f-actina. Os núcleos foram contra-identificados com DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Figura 6: TGF-βsignaling e TGF-β induzido EMT foram inibidos por SB431542 e GW788388. ( A )Ascélulas NMuMG foram tratadas com 10 μM de SB431542 (SB) ou as concentrações indicadas de GW788388 (GW) na presença ou ausência de TGF-β (5 ng/mL) durante 1 hora. Os lysatos celulares foram imunoblottados para p-SMAD2, SMAD2/3 e GAPDH. (B) As células NMuMG foram tratadas com 5 μM de SB431542 (SB) ou 10 μM de GW788388 (GW) na presença ou ausência de 5 ng/mL de TGF-β por 1 hora e imunofluorescência manchada para detectar a translocação nuclear de SMAD2/3 (verde). As imagens foram capturadas com microscopia confocal. (C) A expressão de genes alvos TGF-β, incluindo PAI-1 e genes codificando marcadores EMT, incluindo SNAIL, E-Cadherin e Fibronectin, foram analisados por reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) em células NMuMG após tratamento SB ou GW e estimulação TGF-β por 48 horas. GAPDH serviu como um controle de carregamento. O controle denota células não tratadas. Esta figura foi modificada de Petersen M. et al. 34 com permissão do editor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Figura 7: Células cancerígenas de mamárias py2T derivadas do EMT podem ser induzidas a se diferenciar em adipócitos. As células cancerígenas de mama murina py2T foram estimuladas com 2 ng/mL TGF-β por 20 dias para induzir o EMT completo. Em seguida, as células foram tratadas com DMSO como controle de veículo ou rosiglitazone (2 μM) por 10 dias para permitir a diferenciação de células cancerígenas mesenquimais e induzir adipogênese. O meio era trocado a cada 2 dias. Após 10 dias de tratamento, as células foram manchadas com óleo vermelho O. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>espécie</td>
			<td>Nome genético</td>
			<td colspan="2">Para a frente (5' a 3')</td>
			<td colspan="2">Reverso (5' a 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">humano</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINE1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">rato</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>caracol</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Primers usados para qRT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-ÃŽÂ² Signaling and TGF-ÃŽÂ²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.4K visualizações.  Leiden University Medical Center. Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Vídeo: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Pesquisa do câncer

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an anti-inflammatory drug to standard cancer regiments may improve patient outcome. One such drug, aspirin (acetylsalicylic acid, ASA), has been explored for cancer chemoprevention and anti-tumor activity. Besides inhibiting the cyclooxygenase 2-prostaglandin axis, ASA&#39;s anti-cancer activities have also been attributed to nuclear factor &#312;B (NF&#312;B) inhibition. Because prolonged ASA use may cause gastrointestinal toxicity, a prodrug strategy has been implemented successfully. In this prodrug design the carboxylic acid of ASA is masked and additional pharmacophores are incorporated.
This protocol describes how we synthesized an aspirin-fumarate prodrug, GTCpFE, and characterized its inhibition of the NF&#312;B pathway in breast cancer cells and attenuation of the cancer stem-like properties, an important NF&#312;B-dependent phenotype. GTCpFE effectively inhibits the NF&#312;B pathway in breast cancer cell lines whereas ASA lacks any inhibitory activity, indicating that adding fumarate to ASA structure significantly contributes to its activity. In addition, GTCpFE shows significant anti-cancer stem cell activity by blocking mammosphere formation and attenuating the cancer stem cell associated CD44+CD24- immunophenotype. These results establish a viable strategy to develop improved anti-inflammatory drugs for chemoprevention and cancer therapy.

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&amp;#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NF&#954;B and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.

Síntese e Caracterização de um pró-fármaco Aspirina-fumarato que inibe a actividade NFkB e da mama câncer de células estaminais

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue and its role in local recurrence at the primary tumor site are unknown. Here we present a method for the decellularization, lyophilization, and fabrication of ECM hydrogels derived from murine mammary fat pads. Results are presented on the effectiveness of the decellularization process, and rheological parameters were assessed. GFP- and luciferase-labeled breast cancer cells encapsulated in the hydrogels demonstrated an increase in proliferation in irradiated hydrogels. Finally, phalloidin conjugate staining was employed to visualize cytoskeleton organization of encapsulated tumor cells. Our goal is to present a method for fabricating hydrogels for in vitro study that mimic the in vivo breast tissue environment and its response to radiation in order to study tumor cell behavior.

This protocol presents a method for decellularization and subsequent hydrogel formation of murine mammary fat pads following ex vivo irradiation.

Estudando efeitos de radiação tecidual normais usando Hydrogels de matriz extracelular

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...