Este protocolo pode detectar especificamente nanocristais contendo cálcio na urina humana. Essa técnica poderia potencialmente ser útil para prever estágios iniciais da formação de pedras renais, bem como outras doenças associadas à ureia cristalina. Demonstrando o procedimento será o Dr. Parveen Kumar, um pesquisador IV do meu laboratório.
Que os participantes consumam uma dieta de baixo oxalato por três dias e jejuar durante a noite. Em seguida, colete uma amostra de urina de 24 horas dos participantes antes de que eles consumam uma carga de oxalato. Alimente os participantes com um smoothie contendo frutas e legumes com uma carga de oxalato de aproximadamente oito milômodos.
Os participantes recolhem sua urina por 24 horas após o consumo de oxalato e devolvem no dia seguinte. Mantenha todas as amostras de urina à temperatura ambiente antes do processamento. Medir e registrar pH de urina e volume das amostras de urina.
Misture bem e adicione 50 mililitros de urina em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Centrifugar a amostra a 1.200 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente usando uma centrífuga de bancada. Descarte o supernasce, depois lave e resuspenque a pelota novamente com cinco mililitros de 100% de etanol.
Centrifugar a amostra a 1.200 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente usando uma centrífuga de bancada. Descarte o supernasce e resuspenque a pelota em um mililitro de 100% de etanol. Armazene a amostra a menos 20 graus Celsius para posterior processamento ou proceda imediatamente com a coloração das amostras.
Diluir nanopartículas de ouro do tamanho de 100 nanômetros em água ultrauso a uma proporção de 1:1.000 e usá-las para otimizar as configurações do instrumento. Diluir as amostras de urina 20 vezes na água antes da coloração com cinco milimães Fluo-4 AM por 30 minutos no escuro e analisar as amostras usando NTA. Prepare os cristais de oxalato de cálcio e fosfato de cálcio, conforme descrito no manuscrito do texto antes da análise da NTA.
Ligue o computador e o instrumento, depois abra o software e ligue a câmera. Clique no ícone de captura no canto superior esquerdo da janela para iniciar o modo de captura. Limpe a plataforma bombeando ar para dentro dela usando uma seringa de um mililitro até que a plataforma pareça limpa.
Adicione suavemente água ao aparelho duas a três vezes e use outra seringa mililitro para remover quaisquer bolhas de ar. Uma vez que a plataforma esteja limpa, adicione água e verifique se há alguma contaminação na superfície, visualizando a câmera, em seguida, adicione nanopartículas de ouro como um controle ao injetor de bomba de carregamento de amostra para configurar o instrumento. Ajuste o nível da câmera na tela ou no botão para o lado direito do instrumento até que a imagem comece a exibir pixels coloridos e, em seguida, reduza o nível da câmera.
Em seguida, ajuste a tela para otimizar a imagem. Clique no botão do mouse na imagem do vídeo. Segure o botão esquerdo do mouse e arraste a imagem para cima e para baixo para obter toda a vista.
Configure a velocidade de infusão e concentre a câmera para que as nanopartículas de ouro sejam visíveis na tela da câmera. Defina a velocidade de infusão em alta para a configuração inicial para garantir que as nanopartículas de ouro sejam detectadas. Uma vez detectado, reduza a velocidade para 50 microlitros por minuto para visualizar nanopartículas de ouro.
Ajuste o nível da câmera para visualizar as partículas. Para amostras não manchadas, ajuste o ganho de tela no nível cinco para alcançar o foco da câmera e ajuste o nível da câmera em oito. Quando o foco estiver definido, regissou a amostra.
Após a otimização, limpe o aparelho novamente com água antes de avaliar outras amostras para garantir que a tubulação esteja limpa e que as partículas não estejam presentes. Para analisar amostras manchadas, ajuste a câmera à posição do filtro contendo o filtro fluorescente adequado e carregue amostras diluídas e manchadas no injetor da bomba de carregamento da amostra, reduzindo a velocidade para 20 microliters por minuto para análise. Ajuste o ganho da tela para cinco e o nível da câmera para 13.
Salve os dados após cada medição. Calcule o número médio de nanopartículas para todas as cinco leituras para cada amostra individual e analise os dados usando desvio padrão ou erro padrão da média. Use testes T para análise emparelhada.
Fluo-4 AM foi capaz de se ligar a ambos os cristais oxalatos de cálcio, que tinham entre 50 e 270 nanômetros de tamanho e tinham uma concentração média de 1.260 milhões de partículas por mililitro, e cristais de fosfato de cálcio, que estavam entre 30 e 225 nanômetros e tinham uma concentração média de 2.220 milhões de partículas por mililitro. Amostras de urina de 24 horas coletadas antes da carga de oxalato continham alguns nanocristais urinários entre 110 e 300 nanômetros de tamanho. Em contraste, houve um aumento significativo dos nanocristais urinários presentes em amostras pós-oxalatos.
Para confirmar a reprodutibilidade do método, as amostras foram medidas três vezes e não houve variação significativa nas réplicas técnicas. Ao tentar este protocolo, pode haver alguma dificuldade em adicionar amostras sem bolhas à máquina. Para evitar isso, adicione ar e água à máquina e, em seguida, adicione lentamente amostras.
Além disso, certifique-se de monitorar continuamente suas amostras e que não há bolhas presentes. Este novo método será testado em indivíduos com doença de pedra renal oxalato de cálcio para monitorar a progressão da doença e/ou prever o risco de pedra nos rins.
