Este protocolo permite que qualquer pessoa realize experimentos fret de molécula única para medir distâncias absolutas precisas dentro de biomoléculas usando o smfBox, que é um instrumento barato, robusto e de código aberto. smFRET permite que você olhe para uma molécula de cada vez, em vez da média de muitos bilhões de moléculas, para que você possa caracterizar as diferentes conformações que eles adotam. A beleza deste método é que ele poderia ser usado para lançar luz sobre a estrutura e dinâmica de muitos sistemas biomoleculares.
Por exemplo, dobramento de proteínas, interações de DNA de proteínas e atrosteria de DNA. Antes de iniciar uma análise, inicie o centro de controle a laser e confirme que o modo de corrente constante de onda contínua é selecionado. Força em ambos os lasers.
Inicie o software de aquisição smOTTER e confirme que cada instrumento está configurado corretamente. Para alinhar o caminho de emissão, coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objetivo e coloque cuidadosamente um vidro de cobertura limpo na lente objetiva, baixando em um ângulo para o óleo para evitar a captura de bolhas de ar entre o vidro de cobertura e o objetivo. Em seguida, adicione 10 microliters de 100 corante Cy3B nanomolar no centro do vidro de cobertura.
No painel de ciclos de serviço a laser, defina o laser do doador para zero, 45 ligados e 55 desligados. Defina o laser aceitador para 50, 45 ligados e cinco desligados. Defina a excitação do laser alternado ou o período ALEX para 100 microssegundos.
Abra a guia de foco Z. No painel de aquisição, troque os lasers para viver e ligar a câmera. Ajuste a exposição para que um ponto brilhante apareça centralmente cercado por um fundo preto.
A partir de uma posição Z baixa, aumente a altura até que o ponto brilhante atinja seu tamanho mínimo. Em seguida, eleve a altura até 20 micrômetros adicionais para concentrar o laser na amostra acima do óleo e cobrir o vidro. Quando a amostra entrar em foco, pare a câmera.
No centro de controle de omicron, baixe a potência do laser verde enquanto monitora a escala do eixo y na aba de alinhamento do SMOTTER até que a leitura de ambos os detectores seja observada, alterando a escala conforme necessário. Em seguida, desaparafusar os quatro parafusos na frente do smfBox para remover o painel frontal. Para alinhar o orifício, gire o botão X no posicionador do orifício enquanto observa o sinal na aba de alinhamento para aumentar o sinal em verde e vermelho.
Gire o botão Y para alinhar o orifício na outra direção e volte para o botão X para verificar se há mais aumento no sinal. Para alinhar a lente do orifício, gire o botão X da lente em uma direção para diminuir o sinal e, em seguida, gire o botão X pinhole na mesma direção para retornar o sinal ao nível original. Se o novo sinal máximo for mais alto do que antes, continue a mover iterativamente os botões do orifício e da lente nessa direção.
Se o sinal estiver mais baixo do que antes, mova iterativamente os botões na direção oposta, repita o alinhamento usando os botões pinhole e lente Y. Para o alinhamento da lente fotodioda de avalanche, começando pelo fotodiodo de avalanche verde, mova o botão X até que o sinal verde esteja no máximo. Repita a modificação do sinal para o botão Y.
Retorne ao botão X, movendo-se para frente e para trás para encontrar os pontos limiares em que o sinal começa a cair. Deixe o sinal em uma posição no meio do caminho entre esses dois pontos. Encontre a posição do meio para o botão Y e repita o alinhamento para o fotodiodo de avalanche vermelho.
Antes de analisar a primeira amostra, limpe o estágio com tecido de limpeza de lentes encharcadas de metanol, limpando suavemente o objetivo de uma ponta para a outra e aplique de três a quatro gotas de óleo de imersão no centro do objetivo. Adicione 10 microlitros de água ultrapura tipo um ao centro de um copo de cobertura limpa e monitore o traço de água para confirmar que não são observados sinais fluorescentes. Em seguida, use pinças de borracha para remover cuidadosamente o vidro de cobertura e repor o óleo de imersão, se necessário.
Para garantir que um dado de molécula única seja obtido, após a diluição da amostra, selecione uma concentração na qual uma a cinco rajadas por segundo são observadas no painel de rastreamento vivo. Quando a concentração apropriada for determinada, pressione isoladores de silicone de oito a nove milímetros de diâmetro no centro de um novo vidro de cobertura e adicione cuidadosamente 10 microliters de amostra no centro, evitando o contato com o silicone. Coloque firmemente o segundo vidro de cobertura sobre os isoladores até formar uma vedação.
Verifique o histograma de estoquisometria ao vivo versus eficiência FRET para observar se a amostra está se comportando como esperado. No painel de configurações de salvamento, insira as informações para o nome e os detalhes da amostra, rótulos de doadores e aceitadores, comprimentos de onda de buffer, doadores e aceitadores, comprimentos de onda de detecção e energia laser, afiliação do usuário final e do usuário. No painel de aquisição, digite o comprimento do experimento em minutos e selecione um intervalo de salvamento apropriado para mitigar qualquer perda potencial de dados em caso de erro.
Selecione salvar poderes de laser, se necessário, clique em começar a adquirir os dados. Em um resultado positivo, entre cinco e uma rajada será obtida por segundo. Em um resultado negativo, muitas ou poucas rajadas serão observadas dentro do mesmo período de tempo.
Após a coleta e análise, o enredo de alternância deve coincidir com o período ALEX da configuração experimental. O rastreamento de tempo é usado para avaliar qualitativamente que a concentração amostral é razoável. O gráfico de fundo mostra a distribuição dos períodos de atraso entre fótons com um ajuste linear para os tempos mais longos para estimar a taxa de fundo.
O traço de fundo pode ser usado para identificar se houve alterações na amostra ao longo da duração do experimento. Histogramas de stoquiometria versus eficiência FRET são gerados, selecionando para todas as espécies e espécies duplamente rotuladas. Um histograma de eficiência 1D FRET é gerado com o encaixe gaussiano dos dados.
Então a concentração da amostra aqui é fundamental. Se for muito alto, você não está mais fazendo um experimento de molécula única, enquanto que se for muito baixo, levará muito tempo para obter os dados. Permitiu a determinação de estruturas de biomoléculas dinâmicas, que não poderiam ser determinadas por outros métodos como RMN ou cristalografia.
