Aqui, usamos FRET de molécula única e marcação de proteína site-specific através de uma incorporação natural de aminoácidos para estudar a dinâmica conformacional do mGluR2. Isso permite estudar a dinâmica da proteína sem perturbar a estrutura da proteína. A estrutura atômica fornece uma imagem estática de uma proteína.
No entanto, o FRET de molécula única nos permite visualizar toda a gama de movimentos de proteínas em tempo real e solução. Este método pode ser aplicado para estudar a dinâmica de qualquer proteína. Além disso, uma incorporação natural de aminoácidos pode ser usada para estudar as interações proteína-proteína e a engenharia de receptores sintéticos.
O carregamento de amostras e a otimização de imagens exigem paciência e prática. Para começar, marque os orifícios a serem perfurados na lâmina de vidro com um marcador. Use um Dremel para fazer pequenos furos no escorregador enquanto o escorregador é mergulhado em água.
Sonicate as lâminas e cobrir deslizamentos em acetona por 30 minutos em um sonicator de banho a 23 graus Celsius. Elimine a acetona do slide e cubra os frascos deslizantes. Enxágue bem com água e sonicate em hidróxido de potássio de cinco molares por 30 minutos.
Em seguida, lave as lâminas e cubra o deslizamento com água e sonicate em metanol por dois minutos. Deixe os frascos cheios de metanol até a etapa de salinização de aminoácidos. Despeje a mistura de salinização de aminoácidos recém-preparada na lâmina e cubra os frascos deslizantes.
Incubar, sonicatar e novamente incubar as lâminas e cobrir as lâminas em uma mistura de salinização de aminoácidos antes de descartar a solução. Em seguida, lave os frascos com metanol antes de enchê-los com água. Em seguida, lave as lâminas com água.
Seque-os com sopro de ar e coloque-os nas caixas de montagem. Aplique 60 mililitros de solução de PEGylation na lâmina e coloque uma tampa em cima dela. Marque o lado não PEGylated antes do armazenamento.
Após a incubação, desmonte suavemente, enxágue as lâminas e cubra as lâminas com água. Em seguida, seque-os soprando ar e coloque-os em um tubo estéril de 50 mililitros com a superfície PEGylated virada para longe um do outro. Após a passagem das células HEK 293T com EDTA de tripsina a 0,05%, semear as células na cobertura de poli-L/D-lisina desliza.
Coloque o meio padrão com o meio suplementado com AZP para células em crescimento e receptor metabotrópico de glutamato 2, ou expressão de mGluR2. Em seguida, transfecte as células com um reagente de transfecção e incube por 24 horas antes de mudar o meio com meio fresco suplementado com AZP. 20 minutos antes de rotular com corantes alquinos cianino, lave os boletins de cobertura duas vezes com Recording Buffer quente, ou RB, e coloque-os em um meio padrão quente sem AZP.
Em seguida, remova o meio padrão e lave as células com RB antes de adicionar a solução de rotulagem recém-preparada. Incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Após a incubação, retire a solução de rotulagem.
Lave a folha de cobertura contendo células transfectadas duas vezes com o RB e volte a suspender no mesmo meio. Em seguida, exija as células girando a 1.000 g a quatro graus Celsius por cinco minutos e remova o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 80 a 130 microlitros da solução de lise. Quebre o pellet por pipeta.
Em seguida, envolva-o em papel alumínio e coloque-o no balancim a quatro graus Celsius por 30 minutos a uma hora para lisar as células. Pellet a fracção insolúvel por centrifugação a 20 000 g e quatro graus Celsius durante 20 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo frio fresco e armazene-o no gelo.
Remova o slide e o deslizamento da tampa do congelador e deixe-os aquecer à temperatura ambiente no escuro. Monte a câmara colocando as tiras de fita dupla face entre o deslizamento e o deslizamento da tampa, garantindo que as superfícies PEGylated formem o interior da câmara de fluxo. Usando uma ponta de pipeta, pressione a folha de tampa para garantir que a fita esteja em contato com a folha de tampa e deslize.
Aplique epóxi nas bordas do slide. Aplique 40 microlitros de NeutrAvidin 500-nanomolar em cada pista e incube dentro de uma caixa escura umidificada. Após dois minutos, lave cada pista da câmara com 100 microlitros de tampão T50.
Em seguida, adicione 20 solução de anticorpos biotinilados nanomolares e incube por 30 minutos antes de lavar com 200 microlitros de tampão T50 por pista. Ligue o computador e o microscópio. Em seguida, ligue os lasers para aquecer.
Em seguida, ligue a câmera EMCCD e abra o software. Monte a câmara de amostra no estágio de microscópio e adicione a amostra de proteína gradualmente para atingir aproximadamente 400 moléculas por campo de visão. Lave a câmara com 100 microlitros de tampão de imagem suplementado com 0,3 unidades de protocatecuato 3, 4-dioxigenase.
Ajuste o ganho, a taxa de aquisição e as potências do laser para detectar sinais de fluorescência de molécula única nos canais doador e aceitador. Em seguida, excite o doador e adquira vestígios de tempo até que 80% das moléculas doadoras no campo de visão sejam fotobranqueadas. No final do filme, ligue o laser de 640 nanômetros para excitar diretamente o aceitador até que algumas das moléculas sejam fotobranqueadas.
Altere o campo de visão e repita as etapas para excitação do doador e do aceitador para coletar três filmes por condição. Para selecionar traços FRET de molécula única de coleta de partículas, selecione os traços em que a intensidade total dos traços do doador e do aceitador é estável ao longo do tempo. Em seguida, selecione os traços com mudanças anti-correlacionadas nas intensidades do doador e do aceitador.
Selecione as moléculas doadoras e receptoras que mostram fotobranqueamento de passo único e vestígios com mais de cinco segundos de duração. Calcule a deficiência de FET. Finalmente, identifique o estado conformacional pela Modelagem Oculta de Markov, ou HMM, seguindo as etapas descritas no manuscrito.
A marcação do AZP por corantes de cianina foi obtida por uma reação de cicloadição catalisada por cobre e resultou em marcação efetiva da membrana plasmática de 548UAA com a população da superfície celular marcada com fluoróforos doadores e aceitadores. Na eletroforese SDS-PAGE, uma única banda a 250 kilodalton foi observada em células HEK 293T expressando 548UAA, que coincidiu com o mGluR2 dimérico de comprimento total. Traços seletivos representativos para múltiplos eventos de branqueamento de curta e longa duração para doadores e aceitadores são mostrados aqui.
Os estados conformacionais foram identificados por meio da análise HMM. Transições entre estados FRET discretos foram extraídas dos ajustes idealizados e plotadas como um mapa de calor de densidade de transição. Os traços idealizados do FRET também fornecem informações sobre o tempo de permanência para cada confirmação identificada.
Os traços da molécula única com o canal doador e aceitador são mostrados aqui. Além disso, a FRET de molécula única revela quatro estados conformacionais do domínio rico em cisteína mGluR2. A preservação eficiente do pico é essencial para a retirada de uma única molécula, e deve-se tomar cuidado durante esse processo.
Além disso, o agente eliminador de oxigênio deve ser adicionado imediatamente antes da imagem. Este método de marcação e experimentos FRET de molécula única foram aplicados a múltiplos receptores e forneceram novos insights sobre o mecanismo de ativação do receptor e modulação da função do receptor.
