Essa técnica permite observar longos processos biológicos em câmaras de óvulos drosophila dissecadas, como a migração nuclear oótida, utilizando microscopia de imagem viva. Este protocolo descreve como manter vivas as câmaras de ovos dissecadas durante 12 horas para realizar microscopia de imagem ao vivo. Para começar, pipeta 200 microliters de Schneider Medium e suplemento com 30 microliters de 10 miligramas por insulina mililitro, em seguida, adicionar quatro microliters de soro fetal inativado de calor.
Use uma ponta de pipeta para aplicar uma pequena quantidade de graxa de silicone ao redor do orifício na parte inferior da lâmina perfurada. Posicione uma mancha de cobertura e use a extremidade larga de uma ponta de pipeta para aplicar pressão na mancha de cobertura para achatar a graxa de silicone para criar um interior de anel de silicone no slide. Transfira as moscas fêmeas anestesiadas para o poço de dissecação contendo 150 microliters do meio de imagem.
Para dissecar a fêmea, use os fórceps para pegar o tórax e beliscar a cutícula dorsal do abdômen com um segundo par de fórceps. Remova cuidadosamente o útero, oviduto e baanha muscular. Isole e desprende o par de ovários visíveis na abertura da cutícula.
Coloque uma gota de 10 a 15 microlitres do meio de imagem nos ovários e transfira um ovário para a câmara de imagem. Para separar os ovários, use a agulha para segurar a extremidade posterior do ovário. Use outra agulha para puxar cuidadosamente o germário para provocar os ovários.
Segure a baia com uma agulha e puxe o ovário através das câmaras maiores com outra agulha para remover a baásia muscular restante nas câmaras de ovos. Deixe o ovário descompanhado afundar e entre em contato com a tampa. Remova os estágios finais e o resto dos ovários da microcâmara usando fórceps.
Use agulhas para distanciar cuidadosamente os ovários para facilitar a aquisição. Corte um pequeno quadrado de 10 por 10 milímetros da membrana permeável. Aplique cuidadosamente a membrana na parte superior do meio de imagem para expelir quaisquer bolhas de ar.
Em seguida, selar hermeticamente a câmara com uma fina camada de óleo de halocarboneto ao redor do poço no contorno da membrana. Coloque a configuração de imagem no suporte de slides do microscópio invertido e use um objetivo de 40X. A migração do núcleo oócito de uma câmara de ovos tipo selvagem foi capturada por meio de microscopia de imagem viva.
O núcleo atinge a membrana plasmática anterior ou a membrana plasmática lateral antes de deslizar ao longo das trajetórias para alcançar sua posição final na intersecção das duas membranas plasmáticas. Deformidades de membrana, células foliculares desorganizadas, células atrofiadas e núcleos encolhidos são os primeiros sinais de câmaras de óvulos morrendo. O oócito degenerado antes de oito horas de imagem não é normalmente detectado.
No entanto, casos raros de degeneração precoce são devido a problemas durante a dissecção ou etapas de montagem. Danificar as câmaras de ovos compromete sua sobrevivência. Tão delicado dissecção precisa da mão e preparação da microcâmara são primordiais.
Este procedimento nos permitiu visualizar que o núcleo oócito pode tomar três trajetórias diferentes durante sua migração e diferentes organelas regulam essas trajetórias dentro do oócito.
