Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como os mecanismos de migração celular neuronal. A principal vantagem dessa técnica é que você pode detectar migração celular individual e coletiva a longo prazo. Depois de isolar 200 mililitros de cultura bacteriana pelo método alcalino de lise, misture os dois plasmídeos, de modo que a concentração final de cada um seja de quatro microgramas por microliter.
Incubar os ovos de galinha férteis horizontalmente a 38 graus Celsius em 70% de umidade relativa. Depois de dois dias e meio, use uma seringa de 20 mililitros com uma agulha de calibre 18 para eliminar cinco mililitros de albumina do lado pontiagudo do ovo. Sele o buraco com fita adesiva.
Em seguida, use uma tesoura curva para cortar o topo da casca de ovo e abrir um buraco, com dois centímetros de diâmetro. Sob um estereótipo, verifique o estágio de desenvolvimento do embrião. Sele este buraco maior com fita adesiva.
Continue a incubação a 38 graus Celsius e 70% de umidade relativa até e5,5. Antes da eletroporação, prepare 10 microliters do referido DNA plasmídeo colorido com 0,5 microliters de verde rápido. Além disso, prepare 10 mililitros de PBS autoclaved contendo 100 unidades por mililitro de penicilina, e 100 microgramas por mililitro de estreptomicina.
Use um processador de micropipette para preparar micropipettos feitos de tubos capilares de vidro. Corte a ponta distal da micropipette para um tamanho de poros apropriado para a quantidade de DNA a ser injetada. Use uma tesoura para cortar a casca superior selada para reabrir um buraco, dois centímetros e meio de diâmetro, e coloque o ovo stabily sob o microscópio estéreo.
Deposite algumas gotas da solução PBS preparada no ovo. Usando dois fórceps finos, retire a membrana allantónica que cobre o embrião, tomando cuidado para não causar uma hemorragia. Em seguida, remova o amnion da cabeça do embrião.
Ao girar a cabeça com uma microspatula, use uma micropipette conectada a um tubo de sucção, para injetar entre 0,1 e um microliter do DNA colorido na cavidade ventricular do tecto óptico esquerdo. Coloque um par de eletrodos do tipo fórceps ao redor da área alvo do tectum óptico. Use o gerador de pulso para carregar um pré-pulso de 30 volts por um milissegundo com um intervalo de cinco milissegundos, e para pulsos subsequentes de seis volts por cinco milissegundos com um intervalo de 10 milissegundos.
Depois de tudo isso, feche o buraco com fita adesiva, e continue incubando a 38 graus Celsius e 70% de umidade relativa. Mergulhe os eletrodos em um prato de plástico cheio de PBS, e use uma escova interdental para remover o albumen. Repita o processo desde o corte inicial da casca até a eletroporação de cada ovo.
Um dia antes da Cultura do Monte Plano, começou a preparar a cultura celular codificada Insert adicionando autoclave à água destilada a um prato de cultura celular de 10 centímetros. Flutue alguma cultura celular Inserções na água. Em uma solução contendo oito microgramas por laminina mililitro, e 80 microgramas por mililitro Polly L, certificando-se de cobrir as Pastilhas.
Incubar durante a noite a 37 graus Celsius na incubadora de dióxido de carbono da cultura celular. No dia da cultura em E7.0, removeu a solução de laminina e poli l-lysina da Insert. Em seguida, transfira a Inserção para um prato de fundo de vidro recheado com 1,1 mililitro de meio de cultura.
Transfira o prato para a incubadora de dióxido de carbono da cultura celular a 37 graus Celsius. Coloque uma unidade de câmara úmida em um microscópio confocal invertido com um fluxo de gás de 40% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono, e uma temperatura de 38 graus Celsius. Para começar a preparar uma amostra de tecido na Inserção, use fórceps para beliscar a cabeça do embrião em um prato de cultura celular de seis centímetros contendo HBSS gelado.
Use dois fórceps finos para isolar o tectum óptico eletroporado. E, em seguida, use um conta-gotas de plástico para transferi-lo para um prato de vidro côncavo à base de silício preto e cheio de HBSS gelado. Verifique a posição da rotulagem em microscópio estereoscópico fluorescente.
Usando uma micro faca cirúrgica, corte o tecido tectal ao redor da rotulagem, observando a direção do tecido no tectum. Depois disso, use um caixa de caixa de plástico para transferir o tecido rotulado para a Inserção para que o lado do pino seja anexado ao Insert. Coloque o tecido tectal na direção desejada e remova qualquer excesso de HBSS.
Repita o processo de preparação do tecido para quaisquer outras amostras de tecido destinadas à mesma Inserção. Em seguida, coloque o prato na câmara pré-formada do microscópio confocal invertido. Usando o microscópio confocal invertido, verifique a rotulagem fluorescente e concentre o campo microscópico.
Inicie a unidade confocal a laser. Prove a varredura confocal para ajustar a direção e a posição do tecido ao longo dos eixos x e y no campo. Em seguida, selecione o tamanho da varredura.
Decida o intervalo e o alcance total da varredura confocal ao longo do eixo z. Faça um intervalo de cinco ou 10 micrômetros para a faixa de 100 micrômetros. Escolha o intervalo de tempo da imagem confocal e a duração total da imagem.
Depois de definir os parâmetros do programa de execução confocal, comece a imagem. Uma vez que a imagem esteja completa, combine as imagens confocal em um eixo C diferente para produzir imagens de pilha z com ajuste focal final em cada ponto de tempo. Em seguida, apendice as imagens da pilha Z em diferentes pontos de tempo para construir um filme de lapso de tempo.
Neste estudo, a migração celular é detectada em camadas superficiais através da eletroporação em Ovo, cultura celular de montagem plana e imagem confocal de lapso de tempo. As células tangencialmente migratórias e os núcleos nas camadas superficiais do tectum óptico são vistos aqui zero horas, nove horas, 18 horas e 27 horas após o início da gravação. Um filme de lapso de tempo de intervalos de 10 minutos durante um período de 28 horas e 50 minutos, mostra o movimento em massa das células migratórias e seus núcleos.
O filme mesclado mostra claramente o movimento em massa das células migratórias. A direcionalidade da migração celular pode ser examinada focando nas células dispersas do centro rotulado para todas as direções. As imagens claras do movimento nuclear.permitem o rastreamento automático da migração nuclear usando um plugin de rastreamento de partículas.
Alterações temporais das trajetórias da migração tangencial podem ser visualizadas e provar que a migração dispersa é omnidirecional. Imagens de ampliação mais altas podem ser tiradas em intervalos de cinco minutos. Investigar o comportamento celular individual com a mudança morfológica sequencial do processo de liderança, processo de trailing e núcleos.
Após este procedimento, a rotulagem de ações esclarecedoras pode ser realizada. A fim de responder a perguntas adicionais como os mecanismos da orientação Aksum.
