Este protocolo é significativo porque permite que os usuários preparem amostras de mitocôndrias de tecidos congelados coletados de estudos anteriores e arquivados. Este protocolo também reduz o uso de animais vivos para a colheita de tecidos. Esta técnica permite que os usuários usem tecidos de arquivo previamente congelados para preparar amostras enriquecidas com mitocôndrias, empregando um método de trituração de tecido suave.
Este método de preparação maximiza o rendimento da preparação das mitocôndrias. Através da leitura do protocolo é aconselhável garantir a disponibilidade de todos os componentes e ferramentas, especialmente a unidade de triturador totalmente carregada e também exercitar-se com alguns tecidos indesejados para se familiarizar com as etapas. Demonstrando o procedimento será Edina Kosa, uma pesquisadora associada do meu laboratório.
Para começar, regisse o peso do tubo contendo o tecido cardíaco. Agora pese o tubo vazio e subtraia-o do peso previamente registrado para obter um peso líquido do tecido cardíaco. Coloque o tecido cardíaco congelado diretamente no béquer da solução gelada.
Mexa por cinco minutos. Simultaneamente, o uso de pinças aplica uma leve pressão no tecido para sair o máximo de sangue possível. Retire o tecido com fórceps e aperte o coração com uma toalha de papel filtro limpa para remover o sangue.
Em seguida, coloque o tecido em outro béquer de solução gelada. Depois de mexer o tecido por cinco minutos, seque suavemente o tecido em uma toalha de papel e remova a gordura, o sangue coagulado, as aurículas e a fáscia. Laça o tecido ventricular.
Para triturar as amostras de tecido, coloque de 50 a 300 miligramas de tecido cardíaco na câmara de triturador de tecido do lado do carneiro e feche o lado da carneiro. Em seguida, adicione cerca de 0,2 a 0,8 mililitros de tampão de lavagem ao lado da tampa do tubo. Use a ferramenta do tubo para tampar a câmara de triturador com a tampa do triturador sem apertá-la.
Coloque a câmara de triturador na unidade do suporte do triturador com o lado do carneiro para baixo para a encaixe. Insira e engaje o pouco do condutor de triturador totalmente carregado com a tampa do triturador, garantindo que a broca esteja presa no lugar e, em seguida, aplique pressão para baixo no condutor de triturador na câmara de triturador até que o indicador de pressão no suporte do triturador atinja uma configuração de aproximadamente dois. Pressione o gatilho e execute o condutor do triturador por cerca de 10 a 12 segundos, mantendo a configuração em dois.
Observe o tubo para garantir a trituração e a passagem de toda ou a maior parte da massa tecidual através do disco de lise na câmara superior do triturador e, se necessário, devolva o tubo ao suporte do triturador para continuar triturando. Depois de triturar a amostra, retire a câmara de triturador da unidade do suporte e use a ferramenta do tubo para remover a tampa do triturador e colocá-la em uma superfície limpa para uso posterior recomendado apenas dentro da mesma amostra para evitar contaminação cruzada de outras amostras de tecido. Transfira o tecido cardíaco desfiado para o terceiro béquer com 40 mililitros de tampão de lavagem com uma barra de agitação e mexa o tecido por cinco minutos a uma velocidade média enquanto estiver na placa de mexida.
Filtre a suspensão através de um monofilamento de malha de nylon pré-molhado. Depois de descartar o filtro, lave o tecido desfiado no filtro três vezes com 10 mililitros de tampão de lavagem. Transfira o tecido lavado em um béquer de 50 mililitros com 20 mililitros de tampão de lavagem colocados no banho de gelo na agitação magnética.
Adicione 0,5 mililitro da solução trypsin enquanto mexe constantemente por 15 minutos. Aproximadamente na metade da agitação transfira a suspensão do tecido para um homogeneizador de vidro em vidro portátil que possa conter 15 mililitros de volume. Homogeneize a suspensão com quatro a cinco golpes suaves sem produzir espuma.
Em seguida, coloque o homogeneizar em um béquer de 50 mililitros e misture em uma placa de agitação. Em seguida, adicione 10 mililitros do tampão de isolamento contendo inibidor de trypsina ao homogeneizar e incubar enquanto mexe suavemente. Depois de filtrar a suspensão novamente através de um filtro de nylon, salve o filtro em um tubo cônico de 50 mililitros e transfira a fração de partículas deixada no filtro para o homogeneizador de vidro em vidro.
Em 15 a 20 mililitros do tampão de lavagem e homogeneize suavemente com a mão por 25 a 30 segundos. Depois de combinar o homogeneizar com o filtrado e equilibrar os tubos, centrífuga e, em seguida, usar uma pipeta de plástico remover o supernatante deixando 0,2 mililitros do topo da pelota macia. Filtre o supernatante resultante em um novo tubo cônico usando um filtro de nylon para evitar contaminação e centrífuga mais uma vez.
Depois de descartar a lavagem supernasal da pelota duas a três vezes adicionando o tampão de isolamento ao lado do tubo para evitar quebrar ou contaminar a pelota. Descarte a camada de aro exterior branca fofa cada vez. Adicione cinco mililitros do tampão de isolamento a cada tubo e quebre a pelota usando uma pipeta com uma ponta de um mililitro ou uma nova pipeta de transferência Em seguida, dilua a suspensão com 20 mililitros de tampão de isolamento adicional e centrifugar a suspensão a 8,500 X g por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernascimento da pelota primeiro em cinco mililitros e, em seguida, em um adicional de 15 mililitros do tampão de resus pendente e centrífuga a 8.500 X g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Agora descarte o supernatante e salve a pelota marrom contendo mitocôndrias intactas lavadas. Resuspend a mitocôndria enriqueceu a pelota em 250 microliters do buffer de resuspending, incluindo inibidores de protease.
Aliquot a suspensão em 25 microliters volume, congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenar em um congelador profundo de 80 graus Celsius por vários anos. Seguindo o protocolo, a proteína enriquecida com mitocôndrias foi preparada a partir do coração da prole nascida a dois grupos de porcas. Um foi exercitado durante a gravidez e o outro foi sedentário.
A análise do perfil de proteína etc revelou que a prole de porcas exercitadas apresentava níveis relativamente reduzidos em alguns dos complexos etc. As proteínas mitocondriais foram resolvidas em um BN-PAGE de 3 a 8% gradiente e imunoprobed com coquetéis de anticorpos. Ambos os grupos exercidos e sedentárias exibem múltiplos supercomplexos.
O proeminente aumento do supercomplexo observado foi de nove meses no grupo exercido em comparação com o grupo sedentário. Proteínas enriquecidas com mitocôndrias obtidas de diferentes faixas etárias de 48 horas, três meses, seis meses e nove meses foram analisadas para a atividade complexa I-II utilizando um ensaio cinético. O grupo exercido apresentou atividade complexa I-II em relação à do grupo sedentário.
A viabilidade de estudos funcionais sobre mitocôndrias obtidas a partir de tecidos e células congeladas é demonstrada por outros pesquisadores. A preparação de mitocôndrias obtidas a partir de tecido congelado pode ser aplicada para uma grande variedade de tecidos com dano mínimo.
