Nesta partícula, introduzimos uma plataforma de reconstituição in vitro que imita o ambiente lipídide da membrana interna mitocôndria. Esta plataforma pode ser usada para investigar mecanismos moleculares da fusão de membranas interiores mitocôndrias. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a investigação quantitativa de proteínas de membrana integral e proteínas associadas à membrana em um ambiente próximo nativo.
Para começar, misture as soluções A e B de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, gere a mistura lipídica adicionando o volume calculado da solução de armazenamento em frascos âmbar com uma seringa de vidro. Combine o volume final adicionando clorofórmio extra nos frascos. Asse slides de vidro de microscópio a 520 graus Celsius por 30 minutos.
Depois de assar, esfrie-os à temperatura ambiente. Adicione aproximadamente 10 gramas de hidróxido de sódio a 500 mililitros de metanol durante a agitação. Mexa por duas horas, continuando a adicionar hidróxido de sódio à solução até precipitar começar a aparecer.
Limpe os slides de vidro em solução de sulfato de dodecyl de 10%, metanol saturado com hidróxido de sódio e ácido clorídrico de 50 milômeos, banho sequencialmente sonicando os slides em cada condição por 30 minutos. Limpe os slides de vidro em água ultrauso por 10 minutos entre cada condição. Armazene a tampa limpa selada em solução de ácido clorídrico por até duas semanas para garantir uma boa qualidade de duas camadas.
Limpe o cocho de politetrafluoroetileno do sistema de imersão Langmuir-Blodgett usando clorofórmio e água ultrapura até que nenhum molhar seja observado. Pulverize o clorofórmio na superfície do cocho e limpe-o completamente três vezes com lenços de celulose, depois enxágue-o três vezes com água ultrauso e remova a água através de sucção. Quando terminar, cubra a superfície do cocho com água ultrapura limpa.
Pegue dois pedaços de vidro de cobertura tratado de superfície da solução de limpeza e enxágue-os com água ultrauso por aproximadamente 30 segundos. Coloque o vidro de cobertura de forma de costas para trás usando o grampo do substrato para segurar as lâminas de vidro. Mergulhe o deslizamento de vidro sob a superfície da água clicando manualmente no sistema de controle Langmuir.
Zero o equilíbrio do filme e espalhe cuidadosamente a solução B gota a gota na interface de água de ar. Certifique-se de que os lipídios estão se espalhando apenas na interface da água do ar sem clorofórmio e gotículas lipídicas afundando na parte inferior da superfície do politetrafluoroetileno, o que criará um canal lipídetivo e impedirá a formação de monocamadas. Pare de adicionar lipídios quando a leitura do equilíbrio do filme é em torno de 15 a 20 mililitros por metro.
Aguarde de 10 a 15 minutos, em seguida, inicie o controlador de barreira para alterar a área da superfície clicando no experimento iniciar. Aguarde até que a leitura do balanço do filme aumente para 37 mililitros por metro e mantenha a pressão por aproximadamente 20 a 30 minutos. Levante a tampa a uma velocidade de 22 milímetros por minuto, mantendo a tensão superficial a 37 mililitros por metro.
Uma monocamada lipídica com tethering de polímero será transferida da interface da água do ar para a superfície do vidro de cobertura através do processo de imersão de Blodgett, formando o folheto inferior da bi camada lipídica. Limpe a interface da água do ar por sucção e enxágue o cocho com água ultrapura. Depois de limpar um toboágua de vidro de um poço com clorofórmio, etanol e água ultrauso, coloque-o no cocho sob a camada de água.
Certifique-se de que o poço está voltado para a interface da água do ar e despeje água ultrauso fresca até que o escorregador de vidro esteja totalmente coberto, em seguida, mergulhe o toboágua de vidro sob a superfície da água como descrito anteriormente. Segure a almofada com a monocamada lipídica usando um copo de sucção de silicone e empurre suavemente a monocamada lipídica para a interface de água de ar. Segure o vidro de cobertura por dois a três segundos na interface e empurre-o contra o slide.
Leve o slide para fora com a tampa. Leve a etiqueta e a camada bi-camada para um microscópio de epifluorescência e imagem da bi camada lipídica de acordo com as instruções do manuscrito de texto. Prepare um prato de cristalização contendo água ultrauso e coloque um anel de imagem de microscópio limpo por baixo do prato.
Mergulhe este slide e a tampa da taça que contenham a bi camada lipídica sob a água. Separe suavemente o slide e o vidro de cobertura, segurando o deslizamento da tampa da parte inferior e transfira o vidro de cobertura para o anel de imagem. Substitua a água ultrauso no anel de imagem por um tampão de cloreto de sódio bis-tris, certificando-se de que a bi camada lipídica não esteja exposta a nenhuma bolha de ar.
Adicione 1.1 nanomolar n-octyl-beta-glucopyranoside à bi camada lipídica, em seguida, adicione imediatamente a mistura de 1,2 DDM nanomolar e 1,3 picomoles de L-OPA1 purificado no anel de imagem. Incubar a amostra em um agitador de bancada em baixa velocidade por duas horas. Distribua contas de resina SM-2 de 30 miligramas em três mililitros de tampão bis-tris e agite.
Use uma pipeta de plástico para adicionar 5 a 10 microlitadores das contas de resina SM-2 ao anel de imagem e incuba-la por 10 minutos, depois enxágue as contas de resina. O volume final do buffer no anel de imagem deve ser de 1,5 mililitros. Prepare um miligrama de mistura lipídica A em solução de clorofórmio, depois evaporar clorofórmio sob fluxo de nitrogênio por 20 minutos.
Mantenha a mistura sob vácuo durante a noite para formar um filme lipíduo. Prepare 50 milimonas de cálcio contendo tampão dissolvendo 15,56 gramas de calceína em 50 mililitros de 1,5 solução de hidróxido de sódio molar. Mexa a mistura à temperatura ambiente até que o calcein esteja completamente dissolvido.
Adicione 12,5 milimonas bis-tris e água ultrauso para um volume final de 500 mililitros e ajuste o pH para 7,5. Dispense filme lipídeto em calceina contendo tampão, em seguida, hidrate totalmente o lipídio aquecendo a suspensão a 65 graus Celsius por 20 minutos. Formar lipossomos de 200 nanômetros via extrusão com uma membrana de policarbonato.
Adicione dois microgramas de L-OPA1 em 0,5 micromolar DDM, 2,2 miligramas de lipososom e incubar a solução a quatro graus Celsius por 1,5 horas. Remova o surfactante por diálise com um de diálise de 3,5 quilodalton contra 250 mililitros de 25 mililitros bis-tris, 150 mililitros de sódio e 50 mililitros de cálcio a quatro graus Celsius durante a noite, mudando o tampão duas vezes. Remova calcein extra usando uma coluna de desalting PD10 e, em seguida, procede com imagens e análise de dados, conforme descrito no manuscrito do texto.
Imagens de microscopia de epifluorescência de uma bi camada lipídica e sua fluidez lipídica são mostradas aqui. A distribuição lipídica é mostrada antes e depois do branqueamento da foto e a homogeneidade é mostrada antes e depois da reconstituição. A reconstituída e lipídica bi-camada L-OPA1 foi validada por espectroscopia de correlação de fluorescência ou FCS.
As curvas fcs indicaram que 75% do L-OPA1 foi reconstituído na bi camada lipídica sugerindo que l-OPA1 difunde livremente na bi camada lipídica tethered polímero com o potencial de se auto-montar em complexos funcionais. O branqueamento da etapa de fluorescência indicou que uma média de duas a três cópias de L-OPA1 foram reconstituídas em um dado lipossomo. A distribuição de tamanho dos proteoliposomes reconstituídos L-OPA1 foi testada após a reconstituição utilizando DLS e verificada com FCS.
A tethering de membrana foi monitorada observando o sinal do Texas Red na superfície da bi camada lipídica usando microscopia TIRF. A descamação lipídica da membrana ou a hemifusão foi monitorada através do Texas Red enquanto o marcador liposomino se difundia na bi camada lipídica. Calcein de-saciar ajudou a distinguir a formação completa de poros de fusão apenas de mistura lipídica, permitindo a comparação entre condições onde partículas param na hemifusão e partículas que prosseguem para a fusão total.
A amarração da membrana foi indicada por um sinal lipíduco estável de lipossomos e sinal de derrame não apresentava desapenching no sinal de calcein, mas uma rápida decadência do sinal vermelho do Texas indicou difusão do corante na bi camada lipídica. A fusão completa contou tanto com decadência lipídica quanto lançamento de conteúdo. Ao tentar esta partícula, lembre-se de limpar completamente o vidro de cobertura e o cocho Langmuir para garantir que as duas camadas de alta qualidade sejam fabricadas.
A boa qualidade do ar também é fundamental para evitar defeitos na camada bi. Essa técnica abre caminho para explorarmos novas questões na dinâmica e organização da membrana mitocôndria. Experimento futuro emocionante inclui explorar a influência da assymetria de bi camada, potencial de membrana e mutantes relacionados a doenças na dinâmica da membrana interna das mitocôndrias.
