O protocolo nos permite visualizar as mudanças na segunda reestruturação do DNA induzida pelas proteínas de remodelação de cromatina dependentes de ATP. A mudança na estrutura do DNA pode estar correlacionada com a regulação da transcrição. Esta é uma técnica fácil e altamente sensível que usa uma quantidade muito pequena de DNA puro para registrar as mudanças estruturais no oligonucleotídeo.
Este método pode fornecer informações sobre a regulação da transcrição mediada por proteínas de remodelação de cromatina dependentes de ATP. Para começar, prepare as concentrações de trabalho dos buffers e outros componentes de reação recentemente e mantenha-os a quatro graus Celsius antes de configurar as reações, em seguida, meça a atividade ATPase da proteína na presença de diferentes moléculas de DNA usando um ensaio de oxidação acoplado naDH. Misture 0,1 milimola ADAAD, dois ATP mililitros, 10 DNA nanomolar e 1X tampão REG em uma placa de 96 poços para um volume final de 250 microliters.
Em seguida, incubar a reação por 30 minutos em uma incubadora Celsius de 37 graus e, em seguida, medir a quantidade de NAD+usando o software fornecido junto com o leitor de microplaca. Para medir a absorvância em 340 nanômetros, clique no ensaio NADH e coloque a placa de 96 poços no porta-placas do instrumento e clique no botão de placa de leitura para registrar a absorvência. Colete o espectro de CD em cuvetas de quartzo de alta transparência.
Use cuvetas retangulares ou cilíndricas. Para limpar as cuvetas, lave-as com água várias vezes, depois faça uma varredura da água ou tampão na cuvette para verificar se ela está limpa. Para as reações, use oligonucleotídeos de DNA purificados por PAGE.
Para resfriamento rápido, aqueça o DNA a 94 graus Celsius por três minutos no bloco de aquecimento e esfrie-o imediatamente no gelo. Para um resfriamento lento, depois de aquecer o DNA a 94 graus Celsius por três minutos, deixe esfriar à temperatura ambiente a uma taxa de um grau Celsius por minuto. Para gravar o espectro da linha de base, configure um total de cinco reações de controle uma a uma em tubos de centrífugas mililitros.
Mantenha o volume de reação em 300 microliters em todas as reações. Para gravar o espectro do CD, configure um total de cinco reações experimentais uma a uma em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Para gravar a varredura, ligue o gás e ligue o espectrômetro do CD.
Após 10 a 15 minutos, ligue a lâmpada, ligue o banho de água e coloque a temperatura do suporte em 37 graus Celsius. Em seguida, abra o software de espectro de CD e defina a temperatura para 37 graus Celsius, o comprimento de onda varia em 180 a 300 nanômetros, o tempo por ponto para 0,5 segundos, e o número de varredura para cinco, em seguida, clique no visualizador de dados pro, faça um novo arquivo e renomeie-o com os detalhes do experimento e da data. Em seguida, misture as reações de base e experimentais por pipetação e transfira cuidadosamente as misturas de reação uma a uma para a cuvette, garantindo que não haja bolhas de ar.
Se realizar um experimento de curso de tempo, incubar as reações a 37 graus Celsius pelo tempo necessário, então faça a varredura. Adicione EDTA ao tampão contendo o DNA, ATP, magnésio e proteína para parar a hidrólise ATP. Para inibir completamente a atividade atpase, aumente o tempo de concentração e incubação de EDTA.
Subtrair as linhas de base das reações correspondentes no software e suavizar os dados no software de espectro de CD ou no software de plotagem de dados, em seguida, traçar um gráfico de comprimento de onda contra elipticidade de resíduos médios e analisar os picos. As dobras M mostraram que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar uma estrutura semelhante a um laço de haste. As estruturas de dobra M da frente e a sequência de DNA reverso contendo o GECE G quádruplo são mostradas aqui.
O espectrômetro de CD de GECE resfriado rápido na ausência e presença de ATP e ADAAD mostrou que a ADAAD induz dois picos positivos, um a 258 nanômetros e outro a 210 nanômetros. A adição de EDTA revoga essa mudança conformacional. O espectro de CD agora tem um pico negativo de 210 nanômetros e uma ampla faixa positiva com picos de 230 e 250 nanômetros.
A análise de mapeador QGRS e M-fold mostrou que as regiões promotoras de DROSHA, DGCR8 e DICER possuem o potencial de formar estruturas quádruplas G e semelhantes a troncos. O espectro de CD do par DROSHA cinco mostrou que a ADAAD induz um pico negativo em 210 nanômetros e um pico positivo de 260 nanômetros. Este espectro é uma característica do ADNA.
Os espectros de CD do par DGCR8 um mostrou um pico positivo de 210 nanômetros e um amplo pico negativo de 260 nanômetros. Este espectro é característico da transição B para X. Para o par DGCR8 sete, foram observados fortes picos positivos de 210 e 270 nanômetros e um pico negativo de 250 nanômetros.
Este espectro é característico de estruturas de DNA quádruplo G paralelo. Por fim, para o par DICER um, um pico positivo de 210 nanômetros e dois picos negativos, um a 230 nanômetros e o outro a 260 nanômetros foram observados. Esses picos são característicos de uma transição de DNA de A a X.
Certifique-se de que a pureza do DNA e da proteína é de 99% ou mais. O cuvette deve estar limpo e a linha de base deve ser inferior a um milídeo. Todos os reagentes devem ser puros para que o fundo seja inferior a um milídeo.
