A purificação da proteína recombinante de bactérias é um método bem estabelecido. No entanto, vários problemas podem ocorrer ao usar essas técnicas. Ter métodos para extrair proteína do tecido é certamente atraente.
A principal vantagem com este método é que se pode extrair a proteína em sua forma fisiológica, incluindo todos os efeitos mútuos que podem impactar sua atividade dobrável e catalítica. Esta abordagem pode ser adaptada a outras proteínas de interesse e modificada para outros tecidos. A proteína purificada do tecido pode apoiar o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e inibidores farmacológicos.
Para começar, prepare o tampão de proteína lyse misturando 250 mililitros de PBS com flúor de sódio de 50 milimolar, um flúor de fenilmetilsulfonyl milimolar, dois microgramas por aprotinína mililitro e um ortovanadato ativado milimolar. Filtre a solução usando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Prepare tubos com dois mililitros de tampão de lise por grama de tecido e coloque-os no gelo.
Para preparar a amostra de tecido, disseque o tecido de cerca de 100 miligramas cada um em uma placa de vidro pré-limpa colocada no gelo em uma caixa de espuma de poliestireno. Transfira os pedaços de tecido para os tubos preparados para a lise subsequente. Para preparar uma solução de sulfato de amônio saturado, aqueça 500 mililitros de água dupla destilada a 70 graus Celsius.
Durante a agitação, adicione gradualmente o sulfato de amônio em pó até que não haja mais sulfato de amônio. Esfrie esta solução saturada para a temperatura ambiente e armazene-a a quatro graus Celsius durante a noite. Para homogeneizar os tecidos renais suínos, sonicar a suspensão preferencialmente por uma sonda ultrassônica enquanto mantém a amostra no gelo.
No caso dos tecidos hepáticos do rato, use um homogeneizador elétrico e lave-o regularmente em PBS para evitar entupimentos enquanto mantém as amostras no gelo. Tire 20 microlitros das amostras e verifique sob o microscópio se as células do tecido homogeneizado estão devidamente destruídas. Caso contrário, repita a homogeneização.
Centrifugar os tubos a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Colete o supernatante em um tubo fresco e coloque-o no gelo. Posteriormente, filtre o supernascer utilizando unidades de filtro de seringa de 0,45 micrômetros e 0,22 micrômetros.
Aliquot o supernasal em lotes de 10 mililitros e congele-os a menos 20 graus Celsius para armazenamento a curto prazo ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento mais longo. Prepare uma amostra de 50 microliteres para análise de SDS-PAGE ou western blot adicionando 10 microliters de cinco vezes o buffer amostral SDS a 40 microliters do supernante e, em seguida, fervendo a 95 graus Celsius por 10 minutos. Prepare um gel SDS-PAGE de 12,5% de poliacrilamida de 12,5% de poliacrilamida de acordo com as instruções do fabricante.
Para realizar a análise SDS-PAGE, carregue os poços do gel posteriormente com uma escada marcador de proteína, cinco nanogramas de proteína recombinante FAHD1 humana como controle positivo, 20 microlitrais da amostra a serem analisados e os demais poços com 20 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE preparados. Execute os géis SDS-PAGE a 125 volts usando o buffer de execução SDS. Depois que o SDS-PAGE estiver completo, realize uma análise de manchas ocidentais, teste as membranas usando o anticorpo disponível levantado contra o FAHD1.
Depois de preparar alíquotas supernasas como descrito anteriormente, processe após o descongelamento ou processe diretamente após a extração de proteínas sem congelar a amostra. Filtre a amostra usando uma unidade de filtro de 0,22 micrômetro para excluir possíveis precipitados após o descongelamento. Prepare seis tubos de 1,5 mililitro no gelo e transfira 250 microliters de amostra para cada tubo.
Prepare uma série de diluição de sulfato de amônio nos tubos preparados e compor o volume final para 1.000 microliter com tampão de proteína. Incubar as amostras a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador de tubo. Usando uma centrífuga de mesa, centrífuga a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius e transfira cuidadosamente todos os supernantes em tubos separados.
O ar seque as pelotas resultantes e resuspenque cada uma delas em 1.000 microliter de água dupla destilada. Para cada par de pelotas resuspended e supernadante da etapa anterior, misture 40 microliters com 10 microliters de cinco vezes o tampão amostral SDS e ferva a 95 graus Celsius com tampas abertas até que a maior parte do líquido tenha vaporizado. Em seguida, resuspengue a pelota em uma mistura de 50% de sulfóxido de dimetil em água dupla destilada.
Execute o SDS-PAGE carregando as amostras derivadas das pelotas resuspended e sobrenantes em pares, seguido por uma análise de manchas ocidentais. No entanto, execute os géis a 80 volts por três horas. Configure o sistema FPLC com a coluna de troca aniônica ou cônica.
Lave a coluna com cinco volumes de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada, seguida por cinco volumes de coluna de água dupla destilada. Aplique a amostra na coluna por injeção ou usando uma bomba de amostra e colete o fluxo através. Lave a coluna com um volume de coluna do tampão de sal baixo.
Configure uma elução linear de gradiente de tampão de sal 100% baixo para tampão de sal 100% alto dentro de três volumes de coluna. Colete continuamente uma fração mililitro. Após o gradiente ter terminado, continue a funcionar com um tampão de sal alto até que não sejam detectados mais picos associados à proteína no cromatografia ao longo da faixa de um volume de coluna.
Aplique um mililitro de 25% SDS dissolvido em hidróxido de sódio molar de 0,5 e água dupla destilada para limpar a coluna. Lave consecutivamente a coluna com três volumes de coluna de água dupla destilada e três volumes de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada. Colete as amostras de SDS-PAGE de todas as frações de pico e o fluxo.
Esperje as frações coletadas em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Depois de sondar-os via mancha ocidental, descongelar e juntar as frações contendo as proteínas de interesse e descartar as outras. Para realizar a etapa de purificação, reduza o volume da solução proteica para dois mililitros usando unidades de filtro de ultra centrifugação.
Filtrar sequencialmente a solução com unidades de filtro de seringa de 0,45 micrômetros e 0,22 micrômetros para remover qualquer microprecipitação. Equilibre a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com um volume de coluna de tampão de execução contendo um dithiothreitol milimolar. Coloque a amostra na coluna e execute a unidade de cromatografia até que todas as proteínas sejam elucidadas como descrito anteriormente.
Prepare 50 amostras de microliter para análise de SDS-PAGE e western blot descritas anteriormente. Lavar consecutivamente a coluna com uma coluna de volume duplo de água destilada e um volume de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada. Depois de realizar a análise de manchas ocidentais, acumule todas as FRAções fahd1 contendo frações.
Reduza o volume da solução proteica para dois mililitros usando unidades de filtro de ultra centrifugação. A exibição de manchas ocidentais mostra a presença de fahd1 suíno no supernante com uma banda a 25 kilodaltons, enquanto o controle positivo marcado é executado em 34 kilodaltons. O fahd1 suíno do lysate foi purificado pela cromatografia de troca aniônica e as proteínas de ligação foram removidas por eluição.
Frações contendo FAHD1 suínos foram identificadas pela análise de manchas ocidentais, agrupadas e concentradas. As amostras de proteína foram purificadas pela SEC e identificadas pela análise de manchas ocidentais. O rendimento da proteína fahd1 suína foi de cerca de um miligrama com um nível de 80% de pureza.
A análise da mancha ocidental detectou a proteína FAHD1 do camundongo no fluxo, juntamente com outras proteínas. O fluxo foi aplicado para a cromatografia de exclusão de tamanho. As frações contendo FAHD1 foram agrupadas, concentradas e aplicadas à análise SDS-PAGE.
No entanto, o rendimento da proteína não foi muito alto. A atividade enzimática específica do fahd1 suíno aumenta com o nível de pureza ao aumentar a quantidade relativa de FAHD1 por proteína total. Maiores concentrações de sulfato de amônio causam o efeito sorriso, que pode ser resolvido na menor tensão.
Mais proteínas foram encontradas no liseto e sobrenasce na concentração de 15%. No entanto, em concentrações mais elevadas, as amostras podem precipitar-se e não podem ser detectadas. O protocolo aqui apresentado requer que a proteína seja solucionável.
As condições ideais para precipitação e pH ou ajuste de tamanho para cromatografia precisam ser testadas e definidas. O estudo da função enzimática, a investigação da estrutura proteica e o desenvolvimento de anticorpos são muito apoiados quando se tem proteína extraída do tecido em vez de extraída de bactérias.
