Esta é a primeira tarefa de viés de julgamento do rato a ser validada como sensível a mudanças no estado afetivo, ou seja, humor ou emoção. Pode ser usado para investigar os efeitos de qualquer variável sobre o efeito do rato. Este protocolo usa um design etológico, facilitando a aprendizagem dos ratos, e também é amigável ao bem-estar, já que a tarefa evita o uso de punição ou reforço negativo.
Essa tarefa pode avaliar o impacto da criação ou procedimentos experimentais em estados afetivos de camundongos, tornando-o valioso em diversos campos, como pesquisa de bem-estar animal ou modelagem de distúrbios afetivos humanos. Supondo que os pesquisadores já estejam confortáveis com métodos de manuseio não aversivos, nosso principal conselho é usar pilotos antes do treinamento para identificar misturas de odor apropriadas, ou seja, as que os ratos tratam como ambíguas. Este teste comportamental é uma tarefa de escavação baseada em perfumes, na qual um rato deve cavar para recompensas alimentares de alto ou baixo valor.
O aparelho experimental é composto por uma arena retangular com dois braços. Um braço está sempre centrado e marcado com o odor de estímulo discriminativo positivo ou negativo, e o outro braço é sempre semcenido. Os vasos de escavação incluem um compartimento acessível e inacessível separado por uma barreira de plástico perfurada.
Ambos os potes no aparelho contêm sempre os alimentos de alto e baixo valor, mas as guloseimas são acessíveis dependendo do tipo de braço e ensaio. Durante os testes positivos de treinamento, o rato pode optar por explorar e cavar no braço perfumado, que contém uma panela marcada com um odor de estímulo discriminativo positivo e uma recompensa alimentar de alto valor enterrada. O rato também pode optar por cavar no braço semcenido, que é marcado com água destilada e contém uma recompensa alimentar de baixo valor.
Durante os testes de treinamento negativos, o rato pode novamente escolher entre o braço perfumado, que agora contém uma panela marcada com o odor de estímulo discriminativo negativo e nenhuma recompensa alimentar acessível, ou o braço não perfumado, que é novamente marcado com água destilada e contém uma recompensa alimentar de baixo valor. Em seguida, os camundongos são testados em ensaios não reforçados positivos e negativos, onde não há recompensas alimentares disponíveis, e aqueles que aprenderam a tarefa passarão por um teste ambíguo não reforçado. No ensaio ambíguo, o braço perfumado contém uma panela marcada com uma mistura de sinais de odor de estímulo discriminativo positivo e negativo, fazendo o odor ambíguo, enquanto o braço sem perfume é marcado apenas com água destilada, como sempre.
Ratos revelam seus vieses de julgamento neste julgamento ambíguo. Para preparação experimental, utilizando uma seringa de um mililitro ou micropipette, adicione hortelã e extrato de baunilha em tubos de centrífuga rotulados. Diluir os extratos 1:4 com água destilada e misture invertendo várias vezes.
Faça isso diariamente e inverta repetidamente antes de usar para garantir que as misturas sejam frescas e consistentes. Para a mistura de odor ambígua, depois que as essências de hortelã e baunilha foram diluídas, adicione volumes iguais a um tubo de centrífuga para fazer uma mistura de 1:1 das essências diluídas. Em seguida, durante os ensaios reforçados, para o vaso de odor de estímulo discriminativo positivo, coloque um pedaço de chow no compartimento inacessível e enterre um pedaço de chip de banana na área acessível da panela.
Para o pote de odor de estímulo discriminativo negativo, coloque um pedaço de chow e um pedaço de chip de banana no compartimento inacessível. Em seguida, encha a panela com três centímetros de cama de espiga de milho. Não haverá recompensas alimentares na área acessível deste pote.
Para potes não perfumados, coloque um pedaço de chip de banana no compartimento inacessível e enterre um pedaço de comida na área acessível da panela. Durante todos os testes não reforçados, coloque um pedaço de comida e um pedaço de chip de banana no compartimento inacessível. Em seguida, encha a panela com três centímetros de cama de espiga de milho.
Não haverá recompensas alimentares na área acessível deste pote. Depois de encher os potes, use uma seringa ou micropipette para desenhar 100 microliters da mistura de odor apropriada ou água destilada e injetá-la diretamente em cima da espiga de milho em um movimento circular. Em seguida, para preparar os distribuidores de perfume, coloque uma peça de algodão na base do de tecido.
Em seguida, usando uma seringa de um mililitro ou micropipette, desenhe 100 microliters da mistura de odor apropriada ou água destilada e injete-a na peça de algodão. Cubra o de tecido com sua tampa para incluir o algodão perfumado e criar um dispensador de perfume. Coloque as panelas de escavação no final dos braços da arena e os distribuidores de perfume no início de cada braço.
Insira a porta removível imediatamente antes que as ranhuras do bloqueiem a entrada nos braços da arena e crie o compartimento de partida. Realize todas as sessões de treinamento e teste sob a luz vermelha durante a fase escura e ativa do mouse. Acelere o mouse por uma hora em sua gaiola antes de cada sessão de treinamento ou teste, removendo alimentos do funil.
No primeiro dia de treinamento de escavação, coloque as recompensas alimentares em cima da cama de milho de três centímetros em vez de enterrá-las por baixo. Enterre progressivamente as recompensas sob a espiga de milho nos quatro dias seguintes até que estejam localizadas no fundo da cama de três centímetros até o quinto dia. Para iniciar os testes de treinamento, mova o mouse da gaiola de transporte para o compartimento inicial da arena.
Remova a porta de partida, baixe imediatamente a tampa do plexiglass sobre a arena e inicie o temporizador de teste de cinco minutos. Em seguida, registo da latência para escavação como o momento em que a primeira ocorrência de escavação é observada e latência para comer como o momento em que a primeira ocorrência de alimentação é observada. Para o treinamento de discriminação, realize um ensaio reforçado positivo seguido de um ensaio reforçado negativo nos dias 1 a 5.
Nos dias 6 a 10, pseudo-randomize a ordem dos ensaios para que cada rato passe por dois testes positivos e dois negativos por dia. Na fase de testes, realize um teste não reforçado positivo ou negativo para cada mouse diariamente até que os critérios de aprendizagem sejam atendidos. Todos os dias, realize um teste reforçado positivo e um negativo em uma ordem aleatória antes do teste gravado em vídeo, e outro teste reforçado positivo e negativo após o teste.
Certifique-se de que os testes positivos e negativos sejam realizados em ordem alternada ao longo dos dias. Para realizar um teste de teste não reforçado gravado em vídeo, mova o mouse da gaiola de transporte para o compartimento inicial da arena. Em seguida, configure uma câmera de vídeo em um tripé para que ambos os potes no final dos braços estejam à vista e comecem a gravar.
Certifique-se de gravar o cartão de sinalização com o código cego do mouse e o tipo de teste durante a pontuação de vídeo. Remova a porta de partida, abaixe imediatamente a tampa do plexiglass sobre a arena e inicie o temporizador de teste de dois minutos. Após o teste, devolva o mouse à sua gaiola de transporte.
Marque os vídeos de teste positivos e negativos no dia do teste para avaliar se os ratos atenderam aos critérios de aprendizagem. Garanta a pontuação de vídeo no mesmo dia, uma vez que os animais que atenderem aos critérios de aprendizagem serão submetidos a testes ambíguos no dia seguinte. Usando um software de gravação de eventos ou um cronômetro, deixe que o pesquisador que está cego para o tratamento registe a latência de cada rato para cavar e cavar a duração em cada panela durante o primeiro minuto de testes positivos e negativos.
Registo da latência para cavar como o tempo em que a primeira ocorrência de escavação é observada, e duração de escavação como o tempo total que um rato passa cavando. Compare a duração da escavação no pote perfumado entre ensaios positivos e negativos para determinar se os ratos podem discriminar a tarefa. Os critérios de aprendizagem são atendidos se a duração da escavação no pote de odor de estímulo discriminativo positivo for pelo menos o dobro do que para o pote de odor de estímulo discriminativo negativo durante o primeiro minuto de teste.
Para camundongos que atenderam aos critérios de aprendizagem, teste as respostas à mistura de odor ambíguo. Realize um teste positivo e um negativo reforçado em uma ordem aleatória. Em seguida, realize um teste gravado em vídeo usando a mistura de odor ambígua.
Para análise de dados, plote os meios de latência menos quadrados em cada tipo de ensaio para confirmar que a sugestão ambígua apresentada foi interpretada como intermediária. Ao avaliar o viés de julgamento em um e dois minutos de teste, o tipo de ensaio por interação estimulativa-odor discriminativa positiva foi significativo. Isso revela que os camundongos com hortelã como seu estímulo discriminativo positivo interpretaram inesperadamente as misturas ambíguas de odor como positivas, enquanto camundongos com baunilha como seu estímulo discriminativo positivo tratavam as mesmas misturas de odor ambígua como intermediários.
Este achado indicou que apenas camundongos com baunilha como estímulo discriminativo positivo atenderam ao requisito técnico para tratar a mistura de perfumes como intermediário entre o estímulo discriminativo positivo e negativo. Assim, camundongos com menta como estímulo discriminatório positivo foram excluídos das análises subsequentes de viés de julgamento. Dentro de camundongos com baunilha como seu estímulo discriminatório positivo, a habitação influenciou as latências de escavação, com animais convencionalmente alojados sendo mais lentos para cavar em ensaios ambíguos do que ratos ambientalmente enriquecidos, mas não para testes positivos ou negativos.
Essas interpretações pessimistas de pistas ambíguas por camundongos convencionalmente alojados refletem vieses de julgamento negativos indicativos de afeto negativo. Ao executar este protocolo, é importante que o critério técnico seja atendido. Os ratos devem atender ao critério de aprendizagem mostrando que são capazes de discriminar entre pistas, e interpretar a sugestão ambígua como intermediária.
O desenvolvimento desta nova tarefa de viés de julgamento abre as portas para testar hipóteses importantes sobre estados afetivos de camundongos com tanto o bem-estar animal quanto as implicações clínicas.
