Este protocolo pode ser usado para obter maior visão sobre a dinâmica e os papéis das fosfoproteínas ativas durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos. Este protocolo supera a barreira comum da desfosforilação durante o isolamento de proteínas a partir de dois contextos fisiologicamente relevantes, processos faciais do rato e células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas. É imperativo mover-se rapidamente mantendo todos os reagentes e materiais no gelo e usar inibidores de fosfatase em todos os tampões de lise para manter a integridade das proteínas fosfoiladas.
Para começar, coloque o corpo do rato em uma placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima, e pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol. Em seguida, abra a cavidade abdominal beliscando e levantando a pele antes da abertura vaginal com fórceps semken retos. Em seguida, corte a pele levantada em camadas subjacentes com tesoura cirúrgica de lâmina reta em um ângulo de 45 graus em ambos os lados para gerar uma forma em V que se estenda a cada superfície lateral aproximadamente no meio do caminho entre os quatro membros e membros traseiros.
Usando as fórceps Semken, segure um dos chifres uterinos e corte abaixo do oviduto e acima do colo do útero com uma tesoura cirúrgica. Para permitir a remoção completa do chifre uterino, corte o mesometrium, em seguida, transfira o chifre uterino dissecado para 10 mililitros de histologia PBS em uma placa de Petri de 10 centímetros. Da mesma forma, remova o segundo chifre uterino no lado oposto da cavidade abdominal.
Depois, coloque a placa de Petri de 10 centímetros contendo ambos os chifres uterinos no gelo. Sob um microscópio estéreo dissecado, disseca cuidadosamente cada embrião dos chifres uterinos com 5 fórceps finos de Dumont. Em seguida, lentamente afastar o miométrio, decidirua, e chorão.
Em seguida, rasgue e remova o amnion relativamente transparente ao redor do embrião e corte o cordão umbilical que liga o embrião à placenta. Em seguida, transfira cada embrião dissecado para 2,5 mililitros de histologia PBS em um poço individual de uma placa de cultura celular de 12 poços no gelo usando uma tubulação de transferência de plástico cortada. Prepare três pratos petri de 10 centímetros contendo 10 mililitros de histologia PBS e mantenha-os no gelo para serem usados em rotação entre embriões.
Em seguida, transfira um embrião de um poço individual da placa de cultura celular de 12 poços para uma das placas de Petri de 10 centímetros com histologia PBS no gelo usando uma pipeta de transferência de plástico cortada. Sob o microscópio dissecador, separe cada processo maxilar da face usando as fórceps finas, primeiro fazendo um corte no lado anterior de um processo maxilar ao longo do recuo natural que separa o processo nasal lateral no processo maxilar. Em seguida, corte o lado posterior do processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo maxilar e o processo mandibular.
Em seguida, separe completamente o processo maxilar fazendo um corte vertical dos lados anteriores para posteriores do processo maxilar no lado dos olhos do processo maxilar onde as recuos naturais referenciadas acima da extremidade. Usando uma pipeta Pasteur de nove polegadas com uma pequena lâmpada de látex de dois mililitros, transfira o par dissecado de processos maxilares em uma pequena gota de aproximadamente 30 microliters de histologia PBS para uma placa de Petri de 35 milímetros rotulada no gelo. Em seguida, transfira o par de tecidos de processo maxilar para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado no gelo usando a pipeta Pasteur, minimizando a transferência de PBS histologia.
Além disso, remova qualquer excesso de histologia PBS no tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com a pipeta Pasteur. Adicione 0,1 mililitro de tampão de lise NP40 gelado com inibidores de protease e fosfatase adicionados imediatamente antes do uso no gelo. Em seguida, pipeta para cima e para baixo 10 vezes com um PIPETMAN de 200 microliter.
Em seguida, vórtice por 10 segundos, e depois pipeta para cima e para baixo 10 vezes com um PIPETMAN de 200 microliter, evitando a geração de bolhas. Incubar a quatro graus Celsius por duas horas enquanto gira de ponta a ponta usando uma raquete de 1,5 mililitro ou dois mililitros com um revólver de tubo. Em seguida, centrifufique as amostras a 13.500 x g por 20 minutos a quatro graus Celsius e colete o supernascer a um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro no gelo com um PIPETMAN de 200 mililitros.
Primeiro, aspire o meio das células de mesenquime palatal embrionárias do camundongo usando uma pipeta Pasteur de 5,75 polegadas anexada a um sistema de vácuo. Em seguida, lave as células duas vezes com a cultura do tecido gelado PBS e incline a placa para o lado durante a última lavagem para garantir que toda a cultura do tecido PBS seja aspirada. Em seguida, adicione o tampão de lise NP40 gelado com inibidores de protease e fosfatase adicionados imediatamente antes do uso no gelo para lise as células.
Incubar a placa no gelo por cinco minutos com rotação aproximadamente a cada minuto para garantir a cobertura completa da placa. Em seguida, raspe as células da placa usando um levantador de células pré-resfriado, e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro no gelo. Depois, incubar a suspensão celular a quatro graus Celsius por 30 minutos enquanto gira de ponta a ponta usando uma pá de 1,5 mililitro ou dois mililitros com um revólver de tubo.
Em seguida, centrifufique as amostras a 13.500 x g por 20 minutos a quatro graus Celsius e colete o supernascer a um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro no gelo com um PIPETMAN de 200 mililitros. A análise de manchas ocidentais de lises celulares inteiras de células mesenquimos palatinas embrionárias de camundongos imortalizados após a estimulação com ligante PDFG-B de 2 a 15 minutos revelou bandas distintas reprodutíveis para fosfoproteínas que funcionam na altura ou perto da faixa proteica total correspondente. Observou-se aumento nas intensidades da banda de fosfoproteína após o tratamento com um fator de crescimento comparado com as de células não tratadas, enquanto as intensidades totais de banda proteica foram relativamente iguais entre as amostras.
Este protocolo pode ser usado para sondar como perturbações e fosforilação influenciam diretamente a sinalização intercelular, expressão genética e atividade celular em contextos craniofaciais.
