Este protocolo serve para diminuir uma barreira de entrada para experimentação em cultura celular e permite aos pesquisadores avaliar e caracterizar monocamadas celulares aderentes cultivadas em ambientes microfluídicos dinâmicos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a avaliação qualitativa e quantitativa das características da monocamada celular para servir de base para experimentação adicional dependente de monocamada. Este método permite a recapitulação de um epitélio alveolar in vitro, permitindo explorar as respostas dinâmicas durante a síndrome do desconforto respiratório agudo, SDRA, bem como a lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica, a LPIV.
Para começar, obtenha uma matriz de fluxo de canal único. Limpe a superfície de vidro da tampa em um banho ultrassônico. Mergulhe o vidro de cobertura em poli-d-lisina à temperatura ambiente durante cinco minutos.
Em seguida, seque-o a 60 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, afixe adesivos de dupla face em espaçadores Mylar. Corte a laser conforme descrito no manuscrito no vidro da tampa e certifique-se de que os recortes do canal estejam precisamente alinhados.
Afixe uma tampa retangular de vidro na faixa adesiva mais inferior. Utilize os papéis adesivos descascados para cobrir as porções de adesivo ainda expostas. Após a conclusão da montagem, aplique pressão firme e igual na construção.
Usando uma seringa cheia de água deionizada, enxágue o canal. Esterilizar o compartimento do canal em um esterilizador ultravioleta por 30 minutos. Usando uma técnica estéril, tratar o canal com solução de fibronectina humana preparada em PBS e incubar por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius.
Na capela de fluxo laminar estéril, prepare a suspensão de células NCI H441 usando o meio RPMI 1640 com 10% de FBS. Use 0,25 mililitros desta suspensão de célula para encher o canal e uma parte das portas. Usando microscopia de campo claro, verifique se as células foram distribuídas uniformemente dentro dos canais.
Adicione o reservatório de mídia e a torneira ao canal. Comece a cultivar o canal a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Use uma bomba de seringa programável para extrair mídia gasta do canal e mídia fresca para o canal a partir de um reservatório de mídia estéril conectado à entrada do canal.
Em um exaustor de fumaça química, dilua uma solução de formaldeído a 4% em DPBS para criar uma solução de 1% e armazene em um tubo devidamente rotulado. Prepare a solução de formaldeído a 2% de forma semelhante. Transfira as soluções de formaldeído para seringas de cinco mililitros devidamente marcadas.
Retire 20 mililitros de DPBS em uma seringa separada de 20 mililitros que será usada para as etapas de lavagem. Em seguida, remova o canal microfluídico do aparelho de cultura e fixe-o no exaustor de fumaça química. Para montar o aparelho de fixação e coloração, fixe um segmento de tubo de transferência à porta lateral de uma torneira de três vias através de trava Luer macho para o adaptador de farpa da mangueira.
Em seguida, conecte a torneira à porta de entrada da matriz de fluxo. Conecte outro segmento de tubulação de transferência à porta de saída da torneira existente usando o mesmo tipo de adaptador de farpa de mangueira. Finalmente, proteja as extremidades livres de ambos os tubos de transferência agora designados como linhas de resíduos em um recipiente de resíduos químicos e de risco biológico.
Verifique se a torneira está bloqueando a porta de entrada do fluxo e limpe a linha de resíduos com o DPBS. Em seguida, gire a torneira para bloquear a linha de resíduos e lave lentamente as células com dois mililitros de DPBS. Empurre lentamente dois mililitros de 1% fixador através do canal.
Deixe descansar por cinco minutos e repita com 2% de fixador. Em seguida, lave as células três vezes com DPBS fresco, como demonstrado anteriormente. Preparar a solução de saponina a 0,1% conforme descrito no manuscrito.
Coloque DPBS adicionais em uma seringa de 20 mililitros para uso nas etapas de lavagem. Cubra o tubo com papel alumínio. Adicionar o reagente de faloidina corante de actina filamentosa e um reagente Hoechst corante de núcleo à solução de saponina a 0,1%.
Em seguida, transfira a solução para uma seringa coberta com papel alumínio. Lave a linha de resíduos com uma pequena quantidade de solução permeabilizante e colorante. Em seguida, introduza dois mililitros da solução no canal microfluídico.
Cubra o canal com papel alumínio para bloquear a luz. Após 30 minutos, lave a solução permeabilizante com dois mililitros de DPBS duas vezes por cinco minutos cada antes de secar suavemente o canal. Usando uma micropipeta, introduza uma quantidade mínima de um conjunto macio anti-fade mountant no canal microfluídico, garantindo cobrir a superfície inferior completamente.
Em seguida, sele a extremidade do canal. Usando um microscópio de campo claro, verifique rapidamente a integridade da camada celular antes de armazenar o canal em um recipiente para protegê-lo da luz. Teste os locais de imagem fazendo varreduras de referência e z-stacks até que os parâmetros e condições de imagem desejados tenham sido atendidos.
Usando a placa base da matriz de fluxo como referência, construa z-stacks em vários locais ao longo do comprimento do canal. Finalmente, analise dados transversais, dados de mapa de profundidade e quaisquer outras características relevantes para avaliar as propriedades da camada celular. O sucesso do uso da técnica é demonstrado no ambiente de cultura dinâmica microfluídica através da aquisição de imagens a pelo menos um centímetro de distância da entrada e da saída.
Em um experimento representativo de duração de cultura, a produção bem-sucedida de monocamada foi observada quando as células foram cultivadas por 24 horas. No entanto, quando cultivado por 48 horas, observou-se formação indesejável de multicamadas. Os dados coletados de cada um dos cinco locais de imagem do canal microfluídico também revelam a relação entre o aumento da duração da cultura e o aumento da área de secção transversal, sugerindo que a formação de camada irregular ou o crescimento excessivo ocorre dentro de 48 horas após a cultura.
Obteve-se o mapa de profundidade de uma localização central dentro do canal microfluídico cultivado por 24 horas, o que é útil para a avaliação qualitativa das características da camada. Os três aspectos mais cruciais deste protocolo são a construção adequada do canal, as condições precisas de cultura e fluxo do meio e o uso cuidadoso do aparelho de fixação e coloração. Após este procedimento, outros métodos podem ser usados em paralelo para validar a viabilidade experimental das monocamadas celulares produzidas, tais como sensor elétrico de impedância célula-substrato, ECIS, ou resistência elétrica transepitelial, TEER.
