Os ensaios de captura e extensão do D-loop são os primeiros a permitir a quantificação imparcial e direta das etapas de formação e extensão do D-loop durante a recombinação homóloga em células de levedura de crescimento mitoticamente. Esta técnica independente de viabilidade permite o estudo de proteínas no metabolismo da alça D que de outra forma não seriam possíveis de se desvencilhar de papéis posteriores, apenas olhando para os produtos BIR. No futuro, imaginamos a transição desses ensaios para células humanas para entender melhor o papel das proteínas-chave, incluindo o BRCA2 e os casos de bloom e Warner kilo na recombinação homóloga.
Comece centrifugando as amostras por cinco minutos. Ressuscite o pellet em 2,5 mililitros de solução de 1x psoraleno e transfira-o para uma placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Para nenhum controle de reticulação, ressuspenda o pellet em 2,5 mililitros da solução TE1.
Em seguida, defina a fonte de luz UV na parte superior do agitador orbital, ajustado em 50 RPM. Para reticular as amostras usando um reticulante UV com lâmpadas de ondas longas de 365 nanômetros. Posicione as placas de Petri um a dois centímetros abaixo da fonte de luz UV por 10 minutos com agitação suave em uma placa de plástico ou plexiglass pré-resfriada.
Em seguida, transfira a amostra para um novo tubo de 15 mililitros. Lave a placa de Petri com 2,5 mililitros de solução de TE1 e adicione-a ao tubo. Centrifugar as amostras durante cinco minutos.
Descarte o sobrenadante e armazene o pellet a menos 20 graus Celsius. Coloque as amostras no gelo para descongelamento. Simultaneamente, pré-aqueça um banho seco a 30 graus Celsius.
Ressuspeite as amostras em um mililitro de tampão de esferoplaste e transfira-as para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 3,5 microlitros de solução de zimóliase e misture suavemente batendo. Incubar a 30 graus Celsius por 15 minutos.
E então coloque os tubos no gelo. Centrifugar durante três minutos e colocar as amostras no gelo. Lavar as amostras três vezes em um tampão de esferoplaste mililitro e centrifugar as amostras por três minutos.
Ressuspenda as amostras em um mililitro de tampão enzimático de restrição a frio. Centrifugar durante três minutos e colocar as amostras no gelo. Repita a lavagem uma vez.
Ressuspenda as amostras em um mililitro de tampão enzimático de restrição frio 1x. Divida a amostra igualmente em duas. Centrifugar as amostras durante três minutos a 16 000 G a quatro graus Celsius.
Ressuspender um tubo de cada amostra em 180 microlitros de tampão enzimático de restrição de 1,4x com oligos hibridizantes e outro tubo em 180 microlitros de tampão enzimático de restrição de 1,4x sem oligos hibridizantes. Congelar as amostras em nitrogênio líquido. Descongele as amostras no gelo.
Pré-aqueça um banho seco a 65 e outro a 37 graus Celsius. Aliquota 36 microlitros da amostra em um novo tubo de microcentrífuga e quatro microlitros de 1%SDS e misturado batendo suavemente no lado do tubo. Incube a 65 graus Celsius por 15 minutos com batidas suaves a cada cinco minutos.
Coloque as amostras no gelo imediatamente após a incubação. Adicione 4,5 microlitros de 10%Triton X-100 e misture por pipetagem. Adicione 20 a 50 unidades de enzima de restrição EcoR1 ou HindIII de alta fidelidade a cada amostra.
E incubar a 37 graus Celsius por uma hora com agitação suave a cada 20 a 30 minutos. Durante este tempo, banho seco pré-aquecido a 55 graus Celsius e um banho de água a 16 graus Celsius. Adicione 8,6 microlitros de 10% SDS a cada amostra e misture pipetando e batendo.
Incubar a 55 graus Celsius por 10 minutos. Adicione 80 microlitros de 10%Triton X-100 a cada amostra e misture por pipetagem. Adicione 660 microlitros de tampão de ligadura 1x sem ATP, um ATP milimolar a pH 8,0 e oito unidades de ligase de DNA T4 a cada amostra e misture suavemente por inversão.
Incubar 16 graus Celsius por 1,5 horas com uma inversão a cada 30 minutos. Coloque as amostras no gelo imediatamente após a incubação. Após a purificação do DNA, conforme descrito no protocolo, use dois microlitros de DNA purificado para configurar uma reação qPCR de 20 microlitros de acordo com as instruções do fabricante.
Para cada amostra, configure cinco reações de controle e uma reação de quantificação e execute-as em duplicata. A análise do ensaio de DLC duas horas após a quebra de fita dupla ou indução de DSB mostrou que a reticulação do psoraleno é crítica e a eficiência depende do tempo entre a coleta da amostra e a qPCR. Os valores de Cp ARG4 foram semelhantes entre as amostras reticuladas, mas menores para a amostra sem reticulação, uma vez que o DNA sem ligações cruzadas amplifica de forma mais eficiente.
Para todas as amostras, o controle de qPCR da ligadura intermolecular estava dentro da faixa. A indução robusta de DSB foi evidenciada por um sinal de baixa qPCR para o controle que se amplifica em todo o local de reconhecimento da endonuclease HO. Resultados semelhantes foram observados para o controle de qPCR EcoR1.
O sinal de DLC com oligo hibridizante foi calculado normalizando para o controle da ligadura intermolecular. A análise do ensaio de DLE realizada em seis horas após a indução do DSB mostrou que os valores de CP ARG4 foram semelhantes entre a amostra de oligos com e sem hibridização. O controle da qPCR de ligadura intermolecular revelou um sinal aceitável para a amostra de oligos com e sem hibridização, mas um sinal menor para a amostra com falha.
Nas três amostras, houve indução robusta de DSB. Uma vez que a clivagem HindIII depende da restauração do sítio da enzima de restrição pelo oligo hibridizante. Houve diferença significativa na amplificação através do local de clivagem HindIII na fita ressecada entre a largura e sem oligo amostras.
Uma diferença menor na amplificação através do local na fita estendida foi observada porque aqui a clivagem HindIII também depende da extensão. As amostras e o tampão precisam ser mantidos frios em todos os momentos. As amostras devem ser congeladas por flash após ressuspensão em tampão enzimático de restrição a frio de 1,4x com ou sem oligos hibridizantes.
Os efeitos a jusante da formação e extensão da alça D na formação do produto podem ser estudados usando Southern blotting ou ensaios de desfecho genético. Os efeitos na pesquisa de homologia podem ser investigados usando CP alta. A imunoprecipitação da cromatina pode fornecer informações sobre o recrutamento de uma proteína de interesse.
