Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (No. 82122028 to LX), pela National Natural Science Foundation of China (No. 82173094 to LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (No. 2023NSCQ-BHX0087 to SW).

Os camundongos C57BL/6J (referidos a camundongos B6) e os camundongos transgênicos P14 virgens 9,27 utilizados tinham de 6 a 10 semanas de idade, pesando 18-22 g. Homens e mulheres foram incluídos sem randomização ou cegamento. Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Agrícola de Qingdao.
1. Preparação do meio e dos reagentes
<ol><li>Preparar meio de cultura de células de melanoma B16F10-GP, denominado D10 (meio DMEM completo) adicionando DMEM, soro fetal bovino (SFB) a 10%, penicilina/estreptomicina a 1%, L-glutamina a 1% com mais 100 U/mL de puromicina. Manter um D10 estéril e armazenar por até 2 semanas a 2-4 °C.</li>
	<li>Preparar meio R2 (para término da lise de hemácias) adicionando RPMI-1640 com SFB a 2%, penicilina/estreptomicina a 1% e L-glutamina a 1%.</li>
	<li>Preparar tampão de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) adicionando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 2% de FBS e 0,01% de azida de sódio. A adição de azida sódica pode prolongar o tempo de armazenamento do tampão FACS, que pode ser armazenado por meses a 2-4°C.</li>
	<li>Preparar tampão de lise de hemácias (RBL) adicionando 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 e 0,1 mM de ácido etilenodiamino tetracético (EDTA) em água destilada dupla e ajustar seu pH para 7,3. Armazenar o tampão RBL à temperatura ambiente (TR) e ele permanece estável por até 3 meses.</li>
	<li>Preparar o anestésico 2,2,2-tribromoetanol, conforme descrito abaixo.<ol><li>Pesar a quantidade adequada de cristal de 2,2,2-tribromoetanol em um tubo cônico estéril de 50 mL envolvido com papel alumínio. Adicionar uma quantidade adequada de 2-metil-2-butanol no cristal para preparar a solução-mãe na concentração de 500 mg/ml.</li>
		<li>Agite-o para misturar e aquecer o tubo em banho-maria a 37 °C até que o cristal esteja dissolvido. Certifique-se de que todos os cristais estão dissolvidos.</li>
		<li>Misture bem a solução. Filtrar a solução-mãe com um filtro de 0,22 μm para um recipiente estéril. Conservar a solução-mãe congelada, protegida da luz, a -20 °C ou diluir com PBS numa solução de trabalho na concentração de 12,5 mg/ml e armazenada a 4 °C. NOTA: É melhor usar a concentração prescrita, pois concentrações mais altas do líquido são irritantes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação da suspensão de células B16F10-GP
<ol><li>Descongelar e cultivar um frasco de 1 x 106 células B16F10-GP com 5 mL de D10 em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% CO2. Células de subcultura quando atingiram 80% a 90% de densidade conforme descrito a seguir.<ol><li>Descarte o meio de cultura original por aspiração com pistola de pipetagem e lave as células 2x com PBS. Ao limpar as células aderentes com PBS em uma placa de cultura celular, mova o PBS para a parede lateral ou solte-o na placa.</li>
		<li>Após aspiração de PBS, adicionar 0,5-1 mL de solução de EDTA de tripsina a 0,25% à placa de cultura celular ou ao frasco. Agite suavemente para cobrir toda a superfície celular. Colocar a placa ou o balão de cultura celular numa incubadora a 37 °C durante cerca de 1 min ou em RT até que as células sejam arredondadas e separadas. Observe a esfoliação das células com a ajuda de um microscópio invertido.</li>
		<li>Adicione igual volume de D10 recém-formulado para terminar a digestão de tripsina. Purgar a superfície inferior do frasco de cultura celular com uma pistola de pipetagem para garantir que todas as células foram separadas.</li>
		<li>Transfira a suspensão da célula B16F10-GP para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 163 x g por 4 min em RT.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e descartar. Ressuspender as células em 1-2 mL de D10 para precipitação. Transferir a suspensão de células B16F10-GP para uma nova placa ou frasco de cultura celular contendo 8-10 mL de D10 e, em seguida, incubar em uma incubadora celular a 37 °C a 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia da implantação do tumor, coletar células B16F10-GP com densidade de aproximadamente 90%, conforme descrito nas etapas 2.1.1 a 2.1.4. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e descartar. Ressuspender o precipitado celular em 1 mL de PBS.</li>
	<li>Conte as células viáveis usando um hemocitômetro de azul de tripano a 0,4%. Adicione PBS para diluir a célula a 5 x 105 células por 100 μL. Coloque as células no gelo até usar.</li>
</ol>3. Inoculação ectópica de células B16F10-GP na região inguinal bilateral de camundongos
<ol><li>Aspirar 100 μL de suspensão de células B16F10-GP preparadas com uma seringa de 1 mL. Agite a parede do tubo para mover as bolhas para o topo e empurre o pistão para mover a bolha superior para fora.</li>
	<li>Segure o rato em decúbito dorsal, expondo o seu abdómen. Pressione o membro posterior direito do mouse na posição supina com um dedo para que a pele na região inguinal direita fique totalmente exposta (O mesmo com a região inguinal esquerda).</li>
	<li>Retire o pelo do abdômen com creme depilatório e, em seguida, limpe a área bilateral do abdome com algodão contendo etanol 75%.</li>
	<li>Antes de inserir a agulha, certifique-se de que a pele na região inguinal está apertada. Insira a agulha em um ângulo de 45° no espaço subcutâneo da região inguinal da parte superior da coxa. Certifique-se de que a agulha está chanfrada para cima e a profundidade da agulha para 0,5-1 cm.</li>
	<li>Aplique sucção suave antes da injeção, se não houver sangue, injete as células lentamente injetadas no tecido subcutâneo. Ao mesmo tempo, observe um pequeno bolus (formação de bolsa de líquido) na região subcutânea.</li>
	<li>Após a injeção, remova a agulha, coloque-a na caixa de materiais perfurocortantes e devolva o rato à sua gaiola.</li>
</ol>4. Transferência adotiva de células T P14 para camundongos portadores de tumor
<ol><li>Realizar transferência adotiva em camundongos portadores de tumor 6-8 dias após a implantação do tumor, quando os tumores são palpáveis (aproximadamente 3-5 mm de diâmetro). Injetar 4 mg de ciclofosfamida por via intraperitoneal no dia anterior à transferência 28,29,30. NOTA: O objetivo da injeção de CTX é criar espaço no compartimento linfático para células T transferidas por adoção, eliminando transitoriamente linfócitos em proliferação.</li>
	<li>Isolar linfócitos do baço e LNs de camundongos transgênicos P14 virgens conforme descrito abaixo31,32 (6-10 semanas de idade, o mesmo sexo de camundongos portadores de tumor para evitar problemas de rejeição). NOTA: Execute os seguintes procedimentos em um gabinete de biossegurança para garantir condições estritamente estéreis.<ol><li>Prepare dois pratos de 6 cm e adicione 3 mL de meio R2 a um dos pratos e 3 mL de tampão RBL ao outro prato. Coloque um filtro de células de 70 μm na placa de Petri contendo tampão RBL.</li>
		<li>Eutanásia de camundongos P14 em recipientes herméticos contendo isoflurano seguido de deslocamento cervical. Ajuste o número de camundongos P14 de acordo com o número de camundongos receptores.</li>
		<li>Colher os linfonodos baço, inguinal e axilar dos camundongos eutanasiados e transferi-los para placas de 6 cm contendo 4 mL de meio R2 e colocadas sobre gelo.</li>
		<li>Coloque o baço em um coador embebido com 3 mL de tampão RBL, triture o baço com o putter dentro da seringa de 1 mL. Incubar as células em RT por 1-2 min e, em seguida, terminar a reação com 3 mL de meio R2 frio.</li>
		<li>Triture os LNs com o putter dentro da seringa de 1 mL até que apenas o tecido conjuntivo permaneça no filtro com um filtro de células de 70 μm. Enxaguar o filtro com meio R2 frio e transferir a suspensão celular para um novo tubo centrífugo de 15 mL. Centrifugar as amostras a 500 x g durante 6 min a 4 °C.</li>
		<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células com 3 mL de PBS. Use um filtro de células de 70 μm para remover o material floculante da suspensão celular.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular a 500 x g durante 6 min a 4 °C. Ressuspender as células com 3 mL de PBS e colocar o tubo sobre gelo. Pegue uma pequena amostra, misture com azul de tripano e conte as células usando uma placa de contagem de células sanguíneas.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinar a porcentagem de células P14 (CD45.1+CD8+Vα2+ vivas/mortas) por citometria de fluxo. Certifique-se de que as células doadoras transferidas exibam marcadores congênicos distintos com camundongos receptores (camundongos B6 portadores de tumor é CD45.2+). Realizar coloração antes da transferência para verificar o fenótipo correto das células transferidas.<ol><li>Adicionar 5 x 104- 1 x 105 células a um tubo de centrífuga de 1,5 ml contendo 1 ml de tampão FACS. Centrifugar a suspensão celular a 500 x g a 4 °C durante 3 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante, mexa no fundo do tubo para dispersar as células e coloque o tubo sobre gelo.</li>
		<li>Preparar a seguinte mistura de anticorpos conjugados 9,32 diluída em 100 μL de tampão FACS: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Mancha viva/morta, 1:400. (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Centrifugar a mistura de anticorpos a 15.000 x g por 3 min para agregar as partículas. Coloque a mistura sobre o gelo e proteja-a da luz, envolvendo-a em papel alumínio. Só tome o sobrenadante para evitar a aspiração de partículas.</li>
		<li>Ressuspenda as células em 100 μL da mistura de anticorpos e misture completamente agitando a parede do tubo. Depois de envolver em papel alumínio, incube o tubo por 30 min sobre gelo.</li>
		<li>Lave as células 2x com tampão FACS. Centrifugar o tubo a 500 x g a 4 °C durante 3 min. Ressuspender as células com 200 μL de tampão FACS e transferir a suspensão celular para um tubo de fluxo.</li>
		<li>Executar o tubo de fluxo com células coradas em um citômetro de fluxo para determinar a porcentagem de células CD45.1+CD8+Vα2+ vivas/mortas. NOTA: Geralmente, mais de 90% das células T CD8+ de camundongos transgênicos P14 abrigavam Vα2+TCRs, que são específicos para o epítopo H-2Db GP33-41 do LCMV (vírus da coriomeningite linfocítica).</li>
	</ol></li>
	<li>Calcular o número absoluto de células CD45.1+CD8+Vα2+ vivas/mortas multiplicando a sua percentagem e o número de células vivas obtido nos passos 4.2 e 4.3.</li>
	<li>Aspirar 200 μL de P14 (5 x10 5 células) de suspensão com uma seringa de insulina de 100 U e remover bolhas. O número inicial de células P14 virgens transferidas (5 x 103 - 5 x 105) não afetou o fenótipo das células transferidas9.</li>
	<li>Coloque os ratos em uma gaiola e aqueça com uma lâmpada infravermelha por 5-10 min para expandir a veia da cauda. Segure no lugar com um fixador de mouse de tamanho adequado, endireitar a cauda e limpá-la com uma bola de algodão contendo etanol 75% para tornar as veias visíveis.</li>
	<li>Insira a agulha paralela à veia da cauda e puxe suavemente o êmbolo. Se houver sangue fluindo para a seringa, empurre lentamente a suspensão celular para a veia. NOTA: Se houver resistência ou inchaço da cauda durante a injeção, a posição de injeção precisa ser ajustada. O local de injeção deve começar na extremidade distal.</li>
	<li>Após a conclusão da injeção, puxe a agulha rapidamente e pressione o local de injeção suavemente com uma bola de algodão. Retorne o mouse para uma nova gaiola limpa e observe-o de perto por vários minutos para quaisquer efeitos adversos.</li>
</ol>5. Ressecção do tumor primário
NOTA: Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos sejam autoclavados antes do uso. Esterilizar a área de operação dentro da cabine de biossegurança com etanol 75%, seguido de irradiação UV por pelo menos 30 min. Use aventais, chapéus, máscaras e luvas estéreis durante a cirurgia.
<ol><li>Quando o tumor for palpável (aproximadamente 5 mm de diâmetro), ressecção do tumor primário.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos com injeção intraperitoneal de Cetamina (75 mg/kg). Pinça o pé para avaliar o grau de anestesia, se não houver reflexo de dor, indica o momento certo para a cirurgia. Se os membros posteriores foram retirados, fornecer outra dose de 10-30 μL. NOTA: Alternativamente, medetomidina intraperitoneal (1 mg/kg de peso corporal; Domitor) é recomendado para anestesiar camundongos.</li>
	<li>Aplique a pomada preventiva de secagem nos olhos dos ratos. Remova os pelos do abdômen com creme depilatório para expor totalmente o campo cirúrgico.</li>
	<li>Coloque o mouse em um armário de biossegurança e coloque-o em uma placa anatômica coberta com papel absorvente limpo em posição supina de modo que o eixo longitudinal do mouse fique paralelo ao experimentador. OBS: Para manter um ambiente rigorosamente estéril, os seguintes procedimentos devem ser realizados em um gabinete de biossegurança.</li>
	<li>Desinfete o abdômen dos camundongos com uma bola de algodão embebida em iodopovidona. Incisar a pele perto do local portador do tumor com bisturi estéril ou tesoura oftálmica. Insira a ponta da tesoura fechada na incisão para expor claramente o tumor. Ao incisar a pele, certifique-se de não danificar os gânglios linfáticos inguinais.</li>
	<li>Durante a remoção do tumor, mantenha a cápsula o mais intacta possível. Remover cuidadosa e suavemente o tecido conjuntivo adjacente ao tumor com tesoura estéril. Remova o tumor in situ completamente, caso contrário, ele pode recorrer.</li>
</ol>6. Injeção intranodal de células B16F10-GP no linfonodo inguinal
NOTA: Após a eliminação bilateral do tumor, as células B16F10-GP foram injetadas no linfonodo inguinal unilateral e a PBS foi injetada no outro lado.
<ol><li>Aspirar 20 μL (5 x 104 células) de suspensão celular B16F10-GP com uma seringa de insulina 100 U, remover bolhas e, em seguida, injetar em um linfonodo inguinal. Injete um volume igual de PBS no linfonodo inguinal do outro lado.<ol><li>Durante a injeção, insira a agulha a partir da extremidade distal do linfonodo e, em seguida, insira lentamente a agulha no centro do linfonodo. Neste momento, se o fluido é injetado com precisão no linfonodo, o linfonodo pode ser visto para inchar significativamente. NOTA: Quando a agulha é inserida a partir da extremidade distal do linfonodo, certifique-se de não puncionar o nódulo.</li>
	</ol></li>
	<li>Sutura da incisão com 2-3 pontos com sutura 3-0. Desinfete a pele ao redor da ferida com algodão impregnado com iodopovidona. Tome cuidado para contornar os gânglios linfáticos durante a sutura.</li>
	<li>Coloque o rato numa gaiola limpa e mantenha-se aquecido utilizando luz infravermelha na posição de decúbito lateral. Monitore continuamente até que a consciência seja recuperada. Certifique-se de que os ratos que foram submetidos à cirurgia não sejam devolvidos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.</li>
	<li>Dê buprenorfina a cada 4-6 h por 3 dias consecutivos após a operação para aliviar a dor pós-operatória (em uma dose de 0,1-0,5 mg/kg, SQ ou IP). Monitore as áreas de alimentação, bebida, movimento e atividade dos ratos. Normalmente, os ratos se recuperam do trauma cirúrgico dentro de 3 dias. NOTA: Se os ratos não conseguirem retomar a alimentação e as atividades normais e apresentarem quaisquer sinais de infecção, consulte um veterinário para intervenção ou eutanasie-o.</li>
	<li>Sacrificar camundongos em diferentes momentos: dia 8 e dia 18 após injeção intranodal de células tumorais. Recuperar células de doadores ativadas usando análise de citometria de fluxo.</li>
</ol>

Avaliação de células T CD8+ específicas do antígeno durante metástase linfonodal

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis+to+lymph+nodes+requires+yap-dependent+metabolic+adaptation.">Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation.</a> Science. 363 (6427), 644-649 (2019).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1+PD-1+CD8++T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).</li><li>Ashton-Rickardt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+avidity+model+of+T+cell+selection+in+the+thymus.">Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus.</a> Cell. 76 (4), 651-663 (1994).</li><li>Manjunath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+differentiation+is+not+prerequisite+for+generation+of+memory+cytotoxic+T+lymphocytes.">Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes.</a> J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).</li><li>Khan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOX+transcriptionally+and+epigenetically+programs+CD8++T+cell+exhaustion.">TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion.</a> Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).</li><li>North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide-facilitated+adoptive+immunotherapy+of+an+established+tumor+depends+on+elimination+of+tumor-induced+suppressor+T+cells.">Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells.</a> J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).</li><li>Maine, G. N., Mule, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+room+for+T+cells.">Making room for T cells.</a> J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).</li><li>Xue, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+therapy+with+tumor-specific+th9+cells+induces+viral+mimicry+to+eliminate+antigen-loss-variant+tumor+cells.">Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells.</a> Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).</li><li>Prokhnevska, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cell+activation+in+cancer+comprises+an+initial+activation+phase+in+lymph+nodes+followed+by+effector+differentiation+within+the+tumor.">CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor.</a> Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+transplantation+for+assessing+the+dynamics+of+tumor-infiltrating+CD8++T+cells+in+mice.">Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62442 (2021).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-specific+memory+cd8(+)+t+cells+are+strictly+resident+in+draining+lymph+nodes+during+tumorigenesis.">Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis.</a> Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+pd-1/pd-l1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).</li><li>Francis, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+immune+checkpoints+in+lymph+nodes+through+locoregional+delivery+augments+cancer+immunotherapy.">Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy.</a> Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).</li><li>Garner, H., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+crosstalk+in+cancer+progression+and+metastatic+spread:+A+complex+conversation.">Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation.</a> Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Durante a tumorigênese, as células apresentadoras de antígenos (APCs) engolem antígenos tumorais e migram para TdLN, onde formam células T CD8+. Após priming e ativação, as células T CD8+ deixam o TdLN e infiltram o tumor para matar as células tumorais10. Através da ressecção de TdLN e da administração de FTY720, que bloqueiam a saída de células imunes dos órgãos linfoides, vários estudos têm demonstrado o papel fundamental do TdLN em garantir a eficácia...

A imunoterapia do câncer, especialmente o bloqueio do ponto de verificação imune (ICB), revolucionou a terapia do câncer1. O ICB bloqueia os imunorreceptores coinibitórios (como PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), que são altamente expressos em células T CD8+ esgotadas no microambiente tumoral (TME), levando ao revigoramentode células T CD8+ esgotadas2. Considerando a heterogeneidade das células T CD8+ esgotadas, evidências acumuladas revelaram que células T CD8+ tumor-específicas derivadas da periferia, incluindo linfonodos drenantes (dLN), mas não na EMT, medeiam a eficácia do ICB3,4,5,6,7,8. Recentemente, confirmou-se que as células T CD8+ de memória específicas de TdLN TCF-1+TOX (TdLN-TTSM) são os verdadeiros respondedores ao ICB, que incorporam várias propriedades funcionais das células T de memória convencionais e podem expandir e diferenciar-se em células exaustas de progênie após o tratamento com ICB9. Em conjunto, esses achados corroboram a importância do NL na montagem da imunidade antitumoral.
O linfonodo funciona como um local crítico na facilitação do priming e ativação de células T CD8+ tumor-específicas, fornecendo base estrutural e sinais biológicos10. Vários tipos de células cancerosas frequentemente semeiam linfonodo sentinela (LS, o primeiro LN drenando um tumor primário) antes da disseminaçãosistemática11. A presença de metástase no LS está associada a pior evolução no câncer humano e modelos pré-clínicos mostraram que as células tumorais no TdLN poderiam se espalhar para órgãos distantes através dos vasos linfáticos e sanguíneos do nódulo 12,13,14,15. A biópsia do LS representa agora um procedimento padrão para orientar decisões subsequentes de tratamento em muitos tipos de tumores sólidos, o que poderia evitar a ressecção desnecessária de NL não comprometido16,17. Mesmo para o LN envolvido, permanece controverso se e quando a ressecção cirúrgica é necessária, pois vários estudos demonstraram que a remoção do NL regional não apresentou melhora na sobrevida global em comparação com aqueles que receberam radioterapia ou terapia sistêmica sem ressecção regional do NL 18,19. Uma interpretação é que o LN metastático (mLN) com doença microscópica pode reter alguma capacidade de educar células imunes e fornecer alguns benefícios terapêuticos. Assim, é extremamente importante elucidar como a metástase de LN afeta a resposta imune antitumoral, especialmente as propriedades e funções daTSM TdLN-T.
Até o momento, tanto os dados pré-clínicos quanto clínicos têm revelado algumas alterações estruturais e celulares no mLN20. No entanto, as alterações dinâmicas das células T CD8+ tumor-específicas durante a metástase de NL não foram delineadas. Portanto, o desenvolvimento de um modelo convincente de metástase de NL é necessário para uma investigação mais aprofundada. De fato, vários estudos relataram modelos de camundongos mLN de diferentes maneiras 14,21,22. Por exemplo, metástases espontâneas em LNs axilares foram realizadas através do implante de células de câncer de mama 4T1 no coxim gordurosomamário 22. Em outro estudo, Reticker-Flynn e col. geraram linhagens celulares de melanoma com alta incidência de disseminação do tumor primário subcutâneo para LNs por meio da inoculação seriada de células tumorais cultivadas a partir de tecidos mLN dissociados (nove rodadas)14. Outro modelo comumente utilizado foi preparado pela injeção de células tumorais no coxim plantar e os loci metastáticos seriam formados no LN poplíteo22. Notadamente, é difícil avaliar os momentos precisos de intervenção, pois a metástase de NL nesses modelos nem sempre é fiel.
No presente estudo, um modelo metastático de LN murino foi estabelecido através da injeção intranodal de células B16F10-GP23,24, geradas pela inserção mediada por CRISPR/Cas9 da sequência gênica da glicoproteína (GP) do vírus LCMV no genoma da linhagem celular B16F10 9. Em seguida, esses camundongos foram transferidos com células P14 que abrigam receptores transgênicos de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o epítopo H-2Db GP33-41 25,26 e a dinâmica sistêmica e local de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases de NL pôde ser investigada. Nosso desenho experimental fornece um modelo útil para o estudo das respostas imunes, especialmente das células T CD8+ antígeno-específicas durante a metástase do LN, o que exclui a perturbação das células T CD8+ circunstantes. Esses resultados afetariam as opções de tratamento clínico de remover ou reter o mLN e lançariam uma nova luz sobre a manipulação do mLN para alcançar o máximo de benefícios terapêuticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube&#160;</td>
			<td>BEAVER&#160;</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T48402-25G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon&#160;</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1&#160;</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-GP cell line</td>
			<td>Beijing Biocytogen Co.Ltd, China</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER&#160;</td>
			<td>43701/43702/43703&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C0768-25G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide (CTX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>C11995500BT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science&#160;</td>
			<td>R510-22-16&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech&#160;</td>
			<td>A501195-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>L10199&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier&#160;</td>
			<td>RWD Life Science&#160;</td>
			<td>F31034-14&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science&#160;</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science&#160;</td>
			<td>S12003-09&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

draining lymph node metastasis model for assessing the dynamics of antigen-specific cd8+ t cells during tumorigenesis

As células T CD8+ antígeno-específicas tumorais provenientes da drenagem de linfonodos ganham importância acumulada na montagem da resposta imune antitumoral durante a tumorigênese. No entanto, em muitos casos, as células cancerosas formam loci metastáticos nos gânglios linfáticos antes de metastatizar para órgãos distantes. Até que ponto as respostas locais e sistemáticas de células T CD8+ foram influenciadas pela metástase de NL permanece obscura. Para isso, montamos um modelo de metástase de LN murino combinado com uma linhagem celular de melanoma B16F10-GP expressando o neoantígeno substituto derivado do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), glicoproteína (GP) e camundongos transgênicos P14 que abrigam receptores de células T (TCRs) específicos para o peptídeo GP33-41 derivado da GP apresentado pela molécula H-2Db do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I. Este protocolo permite o estudo da resposta antígeno-específica de células T CD8+ durante metástases de NL. Neste protocolo, camundongos C57BL/6J foram implantados subcutaneamente com células B16F10-GP, seguido de transferência adotiva com células P14 virgens. Quando o tumor subcutâneo crescia para aproximadamente 5 mm de diâmetro, o tumor primário era excisado e as células B16F10-GP eram injetadas diretamente no linfonodo de drenagem tumoral (TdLN). Em seguida, a dinâmica das células T CD8+ foi monitorada durante o processo de metástase do NL. Coletivamente, este modelo forneceu uma abordagem para investigar precisamente as respostas imunes de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases de NL.

Cancer immunotherapy, especially the immune checkpoint blockade (ICB), has revolutionized cancer therapy1. ICB blocks the coinhibitory immunoreceptors (such as PD-1, Tim-3, LAG-3, and TIGIT), which are highly expressed in exhausted CD8+ T cells in the tumor microenvironment (TME), leading to the reinvigoration of exhausted CD8+ T cells2. Considering the heterogeneity of exhausted CD8+ T cells, accumulating evidence revealed that tumor-specific CD8+ T cells derived from the periphery, including draining lymph node (dLN), but not in TME, mediate the efficacy of ICB3,4,5,6,7,8. Recently, TdLN derived TCF-1+TOX- tumor-specific memory CD8+ T cells (TdLN-TTSM) was confirmed to be the genuine responders to ICB which embody several functional properties of conventional memory T cells and could further expand and differentiate into progeny exhausted cells upon ICB treatment9. Altogether, these findings corroborated the importance of LN in mounting anti-tumor immunity.
Lymph node functions as a critical place in facilitating the priming and activation of tumor-specific CD8+ T cells by providing structural basis as well as biological signals10. Several types of cancer cells frequently seed sentinel lymph node (SLN, the first LN draining a primary tumor) before systematic dissemination11. The presence of SLN metastasis is linked with poor outcome in human cancer and preclinical models showed that tumor cells in TdLN could spread to distant organs through both the lymphatic vessels and blood vessels of the node12,13,14,15. SLN biopsy now represents a standard procedure to guide subsequent treatment decisions in many solid tumor types which could avoid unnecessary resection of uninvolved LN16,17. Even to the involved LN, it remains controversial whether and when surgical resection is needed as several studies have demonstrated that the removal of regional LN did not exhibit improved overall survival compared to those that received radiation or systemic therapy without regional LN resection18,19. One interpretation is that metastatic LN (mLN) with microscopic disease may retain some capacity to educate immune cells and provide some therapeutic benefits. So, it is critically important to elucidate how LN metastasis affects the anti-tumor immune response, especially the properties and functions of TdLN-TTSM.
Until now, both preclinical and clinical data have revealed some structural and cellular alterations in mLN20. However, the dynamic changes of tumor-specific CD8+ T cells during LN metastasis have not been delineated. Therefore, developing a compelling model of LN metastasis is needed for further investigation. Indeed, several studies have reported mLN mouse models through different ways14,21,22. For example, spontaneous metastasis in axillary LNs was conducted through the implantation of 4T1 breast cancer cells into the mammary fat pad22. In another study, Reticker-Flynn et al. generated melanoma cell lines with high incidence of spread from subcutaneous primary tumor to LNs through serial inoculation of tumor cells cultured from dissociated mLN tissues (nine rounds)14. Another commonly used model was prepared by the injection of tumor cells into the footpad and the metastatic loci would be formed in popliteal LN22. Notably, it is difficult to evaluate the precise timepoints of intervention because LN metastasis in these models is not always faithful.
In the present study, a murine LN metastatic model was established through the intranodal injection of B16F10-GP cells23,24, generated by CRISPR/Cas9-mediated insertion of LCMV virus glycoprotein (GP) gene sequence into the genome of B16F10 cell line9. Then, these mice were transferred with P14 cells which harbor transgenic T cell receptors (TCRs) specifically recognize the H-2Db GP33-41 epitope25,26 and the systemic and local dynamics of antigen-specific CD8+ T cells during LN metastasis could be investigated. Our experimental design provides a useful model for the study of immune responses, especially the antigen-specific CD8+ T cells during the LN metastasis which excludes the perturbation of bystander CD8+ T cells. These results would affect the clinical treatment options of whether to remove or retain the mLN and shed new light on the manipulation of mLN to achieve maximum therapeutic benefits.

Autor em destaque: Um modelo para estudar a dinâmica sistêmica e local de células T CD8 + durante a metástase LN

Modelo de Metástase de Linfonodo Drenante para Avaliação da Dinâmica de Células T CD8+ Antígeno-Específicas Durante a Tumorigênese

This protocol provides a useful reproductive model for the studies of antigen specific CD8 T-cells. They are lymph node metastasis, which excludes the participation of bystander CD8 T-cells. We try to reveal the systemic and local dynamics of antigen specific CD8 T cells They are lymph node metastasis.Recent accumulating evidence revealed that tumor specific CD8 T cells derived from the periphery, especially in tumor draining lymph node, but not in tumor microenvironment met the efficacy of immune checkpoint blockage therapy. Recently we identified this in one positive talks negative tumor sub specific memory T cells in tumor draining lymph nodes of both mice tumor models and human hepatocellular carcinoma patients which serve as general responders to immune checkpoint blockage. It is difficult to evaluate the precise time points of intubation because lymph nodes metastasis through other techniques is not always feasible.This protocol has provided an approach to precisely investigate the antigen specific CD8 T-cells immune responses. The lymph node metastasis, which excludes the participation of bystander CD8 T cells. Our experimental design provides a useful model to investigate the antigen specific CD8 T-cells, the lymph node metastasis and interactions between antigen specific CD8 T cells and other immune cells or stroma cells during lymph node metastasis.We'll try to elucidate how lymph node metastasis affects the anti-tumor immune response, especially the properties and the functions of TDR and TTSM cells. This results would affect the clinical treatment options of whether to remove or retain the MLN and show the new light on the manipulation of MLN to achieve maximum therapeutic benefits.

O diagrama esquemático deste desenho experimental é mostrado na Figura 1A. Um total de 5 x 105 células B16F10-GP em 100 μL de PBS foram implantadas por via subcutânea (s.c.) na região inguinal bilateral de camundongos CD45.2 C57BL/6J. Após 7 dias, esses camundongos portadores de tumor foram injetados intraperitonealmente (i.p.) com 4 mg de CTX, seguido pela transferência adotiva de 5 x 105 células CD45.1+P14 através de injeção intravenosa (i.v.) d...

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O desenho experimental aqui apresentado fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases linfonodais (LN), o que exclui a perturbação de células T CD8+ circunstantes.

Tumor antigen-specific CD8+ T cells from draining lymph nodes gain an accumulating importance in mounting anti-tumor immune response during tumorigenesis. ...

Este protocolo fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8 antígeno-específicas. São metástases linfonodais, o que exclui a participação de células T CD8 do espectador. Tentamos revelar a dinâmica sistêmica e local das células T CD8 antígeno específicas que são metástases linfonodais.Evidências recentes revelaram que células T CD8 específicas do tumor derivadas da periferia, especialmente no linfonodo de drenagem tumoral, mas não no microambiente tumoral, encontraram a eficácia da terapia de bloqueio de checkpoint imune. Recentemente, identificamos isso em uma conversa positiva, células T de memória subespecíficas tumorais negativas em linfonodos de drenagem tumoral de ambos os modelos de tumor de camundongos e pacientes com carcinoma hepatocelular humano, que servem como respondedores gerais ao bloqueio de checkpoint imunológico. É difícil avaliar os momentos precisos de intubação porque a metástase linfonodal por outras técnicas nem sempre é viável.Este protocolo forneceu uma abordagem para investigar precisamente as respostas imunes antígeno-específicas de células T CD8. A metástase linfonodal, que exclui a participação de células T CD8 circunstantes. Nosso desenho experimental fornece um modelo útil para investigar as células T CD8 antígeno-específicas, a metástase linfonodal e as interações entre células T CD8 antígeno-específicas e outras células imunes ou células do estroma durante a metástase linfonodal.Tentaremos elucidar como a metástase linfonodal afeta a resposta imune antitumoral, especialmente as propriedades e as funções das células TDR e TTSM. Esses resultados afetariam as opções de tratamento clínico de remover ou reter o MLN e mostrar a nova luz sobre a manipulação do MLN para alcançar o máximo benefício terapêutico.

draining-lymph-node-metastasis-model-for-assessing-dynamics-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis

860 visualizações.  Qingdao Agricultural University. Este protocolo fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8 antígeno-específicas. São metástases linfonodais, o que exclui a participação de células T CD8 do espectador. Tentamos revelar a dinâmica sistêmica e local das células T CD8 antígeno específicas que são metástases linfonodais.Evidências recentes revelaram que células T CD8 específicas do tumor derivadas da periferia, especialmente no linfonodo de drenagem tumoral, mas não no microambien...