Agradecemos aos membros do laboratório Cuevas-Velazquez pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto IA203422 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT); Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), projeto número 252952; e Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) e CAPD (CVU 1269643) reconhecem a CONAHCYT por sua bolsa de M.Sc.

1. Construção do plasmídeo
<ol><li>Amplificar o quadro de leitura aberto (ORF) que codifica o IDR desejado por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não inclua o códon stop, pois a ORF será ladeada pelos genes que codificam as proteínas fluorescentes. Para a amplificação, foram projetados primers com os sítios de restrição SacI (5') e BglII (3'). NOTA: Para a seção de resultados representativos, usamos AtLEA4-5 como o IDR selecionado. Amplificamos a ORF de AtLEA4-5 a partir do plasmídeo pTrc99A-AtLEA4-512.</li>
	<li>Digerir o produto da PCR ORF por restrição consecutiva com as enzimas SacI e BglII13.</li>
	<li>Obter o plasmídeo comercial pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) da Addgene (https://www.addgene.org/178189/).</li>
	<li>Realizar uma restrição consecutiva usando as enzimas SacI e BglII para remover o AtLEA4-5 ORF do plasmídeo pDRFLIP38-AtLEA4-5, deixando um plasmídeo aberto contendo o par FRET13.</li>
	<li>Purificar os fragmentos de DNA digeridos usando a recuperação em gel de eletroforese em gel de agarose14. Ligate os fragmentos restritos usando DNA ligase15.</li>
	<li>Transformar a reação de clonagem em células competentes de Escherichia coli (DH5α ou cepas relacionadas) e selecionar em placas de Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/mL de ampicilina16. Crescer durante a noite (ON) a 37 °C.</li>
	<li>Isolar e cultivar pelo menos cinco colônias transformadas em nova placa e genótipo por PCR17. Purificar o DNA plasmidial de uma colônia transformada positiva usando métodos padrão de miniprep18.</li>
	<li>Verificar a extração e integridade do DNA plasmidial utilizando eletroforese em gel de agarose19. Verifique a clonagem correta da construção usando o sequenciamento de Sanger20.</li>
</ol>2. Expressão plasmidial em células de levedura
Observação : use técnicas assépticas padrão para executar as seguintes etapas. Use uma capela de fluxo laminar de cultura ou um isqueiro.
<ol><li>Inocular uma faixa de S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) em 3 mL de meio de levedura peptona dextrose (YPD) e crescer ON a 30 °C e 200 rpm. NOTA: BJ5465 é uma cepa deficiente em protease (CH1) recomendada para trabalhar com IDRs. Outras cepas de S. cerevisiae podem ser testadas e utilizadas.</li>
	<li>Centrifugar 1 mL da cultura de levedura saturada durante a noite (OD600 ~ 3-4) a 14.000 x g por 1 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 1 mL de tampão Tris-EDTA (TE) (pH 7,5) agitando suavemente o tubo. Centrifugar a 14.000 x g por 1 min e remover cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 500 μL de tampão Lazy Bones (40% p/v PEG 3.350; 100 mM acetato de lítio; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,5) por pipetagem. Adicionar 25 μL de DNA de espermatozoides de salmão fervido (100 °C por 5 min, seguido de resfriamento no gelo por 5 min) às células de levedura ressuspensas.</li>
	<li>Adicione 100 ng do DNA plasmidial à mistura e vórtice a mistura por 1 min para garantir uma mistura completa. Deixe a mistura repousar à temperatura ambiente por 1-2 h.</li>
	<li>Choque térmico da mistura de levedura a 42 °C por 12 min, depois resfriar no gelo por mais 12 min. Centrifugar o tubo a 14 000 x g durante 1 min e remover cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 1 mL de tampão TE (pH 7,5). Placa 100 μL das células transformadas em meio de levedura sintética sem uracila (SD-ura) suplementada com ágar 15 g/L.</li>
	<li>Incubar as placas a 30 °C por 2-3 dias (Figura 1). Passe pelo menos cinco transformadores de levedura em uma nova placa e cresça ON.</li>
</ol>3. Validação de transformadores de levedura
<ol><li>Escolha uma pequena porção de cada candidato a transformador raspando suavemente e ressuspendendo em 5 μL de NaOH 20 mM em tubos de PCR individuais.</li>
	<li>Aquecer a amostra a 99 °C durante 10 minutos num termociclador para lisar as células e libertar o ADN na solução. Esta etapa é crucial para preparar o molde de DNA para PCR.</li>
	<li>Transferir 1 μL da amostra fervida para uma mistura separada de reacções de PCR contendo os primers e reagentes de PCR adequados para genotipagem. Foram utilizados os seguintes primers: Primer Forward: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. Primer reverso: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.</li>
	<li>Configure uma reação de PCR e valide a presença do plasmídeo correto usando eletroforese em gel de agarose. Selecione um transformador para experimentos adicionais.</li>
</ol>4. Preparação de cultura de células de levedura para ensaio de FRET
<ol><li>Inocular uma faixa do transformador de levedura selecionado em 3 mL de meio líquido 1x SD-Ura. OBS: Faça este procedimento em uma capela de fluxo laminar e material estéril.</li>
	<li>Crescer a 30 °C, 200 rpm por pelo menos 12 h até atingir a saturação. Meça o OD600. O crescimento deve ficar entre OD600 = 1,0-2,0. Observação : se OD600 é menor que 1,0, dê às células mais tempo de incubação para crescer. Se o OD600 exceder 2.0, não prossiga e reinicie a partir da etapa 4.1.</li>
</ol>5. Preparação de células de levedura para ensaio de FRET
<ol><li>Recolher 2 ml da cultura de levedura durante a noite e centrifugar a 14.000 x g à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 1 mL de tampão 50 mM de ácido etanossulfônico (MES) 2-(N-Morpholino) (pH 6).</li>
	<li>Centrífuga a 14.000 x g à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas 5.2 e 5.3. Ressuspender as células de levedura em 2 mL de tampão MES, pH 6 e despejar o volume em um reservatório de reagente.</li>
</ol>6. Configuração das medições de fluorescência
NOTA: A presente varredura é considerada realizada em um leitor de microplacas com modo de fluorescência.
<ol><li>Para configurações básicas, defina o instrumento da seguinte forma: Tipo de medição: Espectro de intensidade de fluorescência (FI); Nome da microplaca: Greiner 96 F-bottom.</li>
	<li>Para configurações ópticas, defina o instrumento da seguinte forma: Não. dos pontos de varredura de comprimento de onda: 91; Comprimento de onda de excitação: 433 nm; Largura de banda de excitação: 10 nm; Comprimento de onda de emissão: 460 - 550; Largura do passo: 1 nm; Largura de banda de emissão: 10 nm; Altura focal obtida por autofoco; Altura focal: 5 mm; Comprimento de onda utilizado para ganho: 490 nm.</li>
	<li>Para configurações gerais, defina o instrumento da seguinte forma: Tempo de liquidação: 0,1 s; Direção de leitura: unidirecional, horizontal da esquerda para a direita, de cima para baixo. NOTA: O ganho inserido manualmente deve ser ajustado para cada medição usando o poço esperado para exibir os níveis mais altos de intensidade de fluorescência em toda a varredura de comprimento de onda.</li>
</ol>7. Preparação de soluções hipertônicas e medidas de fluorescência
<ol><li>Prepare soluções de NaCl 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1 M, 1,5 M e 2 M em uma placa preta de fundo claro de 96 poços. O volume final em cada poço será de 200 μL (150 μL de solução de osmólito + 50 μL de suspensão de células de levedura). NOTA: Outros osmolitos podem ser usados para induzir estresse hiperosmótico. Todas as soluções devem ser preparadas em tampão MES 50 mM pH 6.</li>
	<li>Carregar 150 μL de tampão MES 50 mM, pH 6 nos três primeiros poços da linha A (A1, A2, A3) e nos poços subsequentes, adicionar 150 μL da solução correspondente em ordem crescente da esquerda para a direita (Figura 2). Para testar todas as concentrações sugeridas, continue o carregamento na linha B. NOTA: Esta configuração considera as medições de 3 réplicas técnicas para cada concentração.</li>
	<li>Use uma micropipeta de 12 canais para transferir 50 μL de células de levedura lavadas para cada poço. As células de levedura tendem a sedimentar para o fundo do reservatório. Certifique-se de ressuspender a suspensão de levedura completamente, pipetando para cima e para baixo antes de transferir as células.</li>
	<li>Carregue células na placa de 96 poços contendo as diferentes soluções e misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 4x.</li>
	<li>Meça os espectros de emissão de intensidade de fluorescência imediatamente para os poços desejados em um leitor de microplacas com as configurações de especificação da etapa 6. Repita o procedimento para cada IDR a ser testado no ensaio FET.</li>
	<li>Etapa opcional. Se disponível, meça uma construção somente para doadores (pDRFLIP38-mCerulean3) seguindo as etapas descritas aqui. NOTA: Recomendamos executar esta etapa para calcular a eficiência do FRET de cada condição. Se o leitor não puder executar essa etapa, o FRET pode ser calculado usando o método da razão FET. Ambos os métodos para cálculos de FRET são explicados nas etapas 8 e 9.</li>
	<li>Execute pelo menos três réplicas em três dias independentes para cada construção.</li>
</ol>8. Processamento de dados usando o método de eficiência FRET
NOTA: Para leitores com conhecimento da linguagem de programação R, fornecemos um conjunto de scripts R para executar o processamento de dados descrito nesta seção. Os scripts podem ser encontrados em https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Siga as instruções no arquivo LEIA-ME.
<ol><li>Exporte dados como arquivos .xlsx do leitor de microplacas.</li>
	<li>Normalize os valores de intensidade de fluorescência em cada comprimento de onda de varredura até o ponto isosbestico do par de FRET usado. NOTA: Esta etapa é necessária para comparar os espectros de todas as condições testadas. O ponto isosbestico do par mCerulean3 e Citrino FRET é de 515 nm. Por exemplo, obtenha a razão dos valores de intensidade de fluorescência de 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm, e assim por diante.</li>
	<li>Calcule a média para cada réplica técnica assim que os valores de fluorescência forem normalizados. No total, deve haver uma coluna para cada condição de estresse hiperosmótico.</li>
	<li>Visualize todos os espectros de intensidade de fluorescência no mesmo gráfico (Figura 3). Cada espectro deve exibir uma combinação dos espectros de emissão de fluorescência de cada mCerulean3 e Citrino. Em casos raros, onde a eficiência de FRET é 0, apenas o espectro de emissão de fluorescência do doador será observado, ou quando a eficiência de FRET é 1, apenas a fluorescência do receptor será observada. O pico de emissão de fluorescência para mCerulean3 (doador) é de 475 nm, e o pico de emissão de fluorescência para Citrino (aceitador) é de 525 nm.</li>
	<li>Determine se a medição de fluorescência exibe uma alteração típica de FRET em resposta ao estresse hiperosmótico. Se a conformação da IDR for sensível ao tratamento, isso refletirá como uma mudança na eficiência do FET. Uma mudança típica na eficiência do FRET acoplará uma diminuição na intensidade de fluorescência do doador com um aumento na intensidade de fluorescência do receptor ou vice-versa.</li>
	<li>Quantificar a eficiência do FRIT (EFRET). Obter os valores de pico normalizados do doador (mCerulean3) (475 nm/515 nm) para o construto IDR e o construto somente doador para cada condição de estresse hiperosmótico. Use os valores médios de pico normalizados das réplicas técnicas. Execute essa operação para cada uma das três réplicas independentes. Calcule EFRET com a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66275/66275eq01.jpg" style="margin: auto;"> Onde IDA é a razão 475 nm/515 nm da construção IDR (construção do par FET), e ID é a razão 475 nm/515 nm da construção somente doador.</li>
	<li>Compare as eficiências do FET. Normalizar os valores deE FRET de cada condição de estresse hiperosmótico para oFRET E da condição sem estresse (por exemplo, NaCl 0 M). Faça comparações usando um gráfico de caixa ou um gráfico de curva suave. Realizar uma ANOVA One-way seguida de um teste estatístico post hoc de Tukey (valores de p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).</li>
</ol>9. Processamento de dados usando o método da razão FRET
NOTA: Se não for possível obter medições somente para doadores, execute o método da razão FET. Este método compara a razão FRET entre as diferentes condições de estresse hiperosmótico. As etapas 7.1 a 7.5 devem ser executadas antes das etapas desta seção para validar um comportamento típico de FET. Para leitores com conhecimento da linguagem de programação R, fornecemos um conjunto de scripts R para realizar o processamento de dados descrito nesta seção. Os scripts podem ser encontrados em https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Siga as instruções no arquivo LEIA-ME.
<ol><li>Extraia dados a 475 nm e 525 nm do arquivo xlsx exportado anteriormente do leitor de microplacas. Esses valores correspondem ao pico de emissão de fluorescência para mCerulean3 (doador, DxDm) e ao pico de emissão de fluorescência para Citrino (receptor, DxAm) quando o fluoróforo doador está excitado (433 nm).</li>
	<li>Normalizar os valores de intensidade de fluorescência a 475 nm e 525 nm até o ponto isosbestico do par de FRET utilizado. O ponto isosbestico do par mCerulean3 e Citrino FRET é de 515 nm. Obter a razão FRET (DxAm/DxDm).</li>
	<li>Compare as razões de FET. Normalizar os valores de DxAm/DxDm de cada condição de estresse hiperosmótico para a média de DxAm/DxDm da condição sem estresse (por exemplo, NaCl 0 M). Faça comparações usando um gráfico de caixa ou um gráfico de curvas suaves (Figura 4 e Figura 5). Realizar uma ANOVA One-way seguida de um teste estatístico post hoc de Tukey (valores de p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).</li>
</ol>

Análise FRET da sensibilidade estrutural do IDR para estudar o estresse hiperosmótico em leveduras

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O método apresentado aqui oferece uma maneira de obter insights sobre como as dimensões globais do conjunto de IDRs sentem e respondem a perturbações ambientais. Este método baseia-se em uma construção geneticamente codificada e não requer componentes adicionais além de uma expressão estável de plasmídio em células de levedura, tornando-o adaptável para aplicações potenciais em outros tipos celulares. Além disso, é versátil para explorar outras perturbações físico-químicas que as células eucariót...

Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são componentes críticos nos processos celulares1. Em combinação com domínios estruturados, as IDRs são essenciais para as funções proteicas. A composição de aminoácidos das IDRs é tendenciosa, representada principalmente por resíduos carregados, hidrofílicos e pequenos. Devido a essa propriedade, os IDRs são considerados domínios de baixa complexidade 2,3. Numerosas IDRs têm chamado a atenção, principalmente porque essas regiões desempenham um papel crucial em condições patológicas, particularmente doenças neurodegenerativas. Tais doenças caracterizam-se pela automontagem e subsequente deposição extracelular ou intracelular de IDRs nosneurônios4. Exemplos dessas IDRs incluem β amiloide (Aβ) na doença de Alzheimer, huntingtina (HTT) na doença de Huntington e proteína ligadora de DNA TAR-43 (TDP-43) e fusionadas em sarcoma (FUS) na esclerose lateral amiotrófica e demência frontotemporal4. O estudo dos rearranjos estruturais das IDRs no contexto da doença tem sido significativamente aprimorado por métodos espectroscópicos, incluindo a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET).
A natureza hidrofílica e estendida das IDRs as torna extremamente sensíveis a mudanças nas propriedades físico-químicas do ambiente de solução5. O grau pelo qual o conjunto conformacional das IDRs é modificado pelo ambiente é chamado de sensibilidade estrutural 5,6,7. Diferentes técnicas podem ser utilizadas para estudar a conformação e a dinâmica das IDRs, incluindo dicroísmo circular (CD) e espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS)8,9. Infelizmente, CD e SAXS requerem grandes quantidades de proteínas purificadas, por isso não são apropriados para estudos em células. Em contraste, o FRET é uma técnica que mede a intensidade de fluorescência de duas moléculas fluorescentes que marcam especificamente uma IDR, o que significa que elas podem ser monitoradas em misturas complexas, como células vivas10. Medir dinamicamente a sensibilidade estrutural das IDRs em células vivas é necessário para entender como o ambiente regula a conformação e a função do proteoma desordenado.
FRET é um método poderoso para quantificar a sensibilidade estrutural de IDRs, bem como proteínas globulares e multidomínios em células vivas. O método requer uma construção que consiste em um IDR de interesse prensado entre duas proteínas fluorescentes (FP), conhecido como par FET. Para esse protocolo, sugerimos o uso de mCerulean3 como FP doador e Citrino como PF receptor, devido à sua grande faixa dinâmica, em comparação com outros FPs relatados em estudo anterior sobre sensibilidade dasRRD6. O FRET já foi explorado para medir a sensibilidade estrutural de uma planta IDR em diferentes contextos celulares6. Além disso, essa técnica tem sido utilizada para caracterizar as dimensões proteicas globais das IDRs por diferentes grupos de pesquisa, tanto in vitro quanto in vivo5,11.
Aqui, descrevemos o método de FRET de conjunto para estudar a sensibilidade estrutural de IDRs em células de levedura viva (Saccharomyces cerevisiae). Mostramos resultados representativos que são baseados em uma planta IDR chamada AtLEA4-5. AtLEA4-5 é desordenado em solução, mas dobra-se em α-hélice quando o apinhamento macromolecular é induzido in vitro12. O AtLEA4-5 é um bom modelo de referência para esse método por ser relativamente pequeno (158 resíduos), desordenado e sensível a perturbações ambientais, como relatado in silico e in vitro6,12. O método apresentado aqui pode ser dimensionado para abordagens de alto rendimento, pois as células de levedura são fáceis de cultivar, e o tratamento é aplicado em pequenos volumes. Além disso, pequenas modificações no protocolo podem ser aplicadas a outros sistemas celulares, como bactérias e célulasvegetais6. O protocolo pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia molecular com acesso a um leitor de microplacas com modo fluorescência, equipamento disponível na maioria das instituições de pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são domínios proteicos que participam de processos celulares cruciais. Durante as condições de estresse, as propriedades físico-químicas do ambiente celular mudam, impactando diretamente o conjunto conformacional das IDRs. As IDRs são inerentemente sensíveis a perturbações ambientais. Estudar como as propriedades físico-químicas da célula regulam o conjunto conformacional de IDRs é essencial para a compreensão do controle ambiental de sua função. Aqui, descrevemos um método passo-a-passo para medir a sensibilidade estrutural de IDRs em células vivas de Saccharomyces cerevisiae em resposta a condições de estresse hiperosmótico. Apresentamos o uso da transferência de energia por ressonância de fluorescência de conjunto (FRET) para estimar como as dimensões globais das IDRs mudam durante um aumento progressivo do estresse hiperosmótico imposto às células com qualquer osmólito. Além disso, fornecemos um script para processar medições de fluorescência e comparar a sensibilidade estrutural para diferentes IDRs. Seguindo esse método, os pesquisadores podem obter informações valiosas sobre as mudanças conformacionais que as IDRs sofrem no complexo meio intracelular ao mudar ambientes.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

Autor em destaque: Desbloqueando o mundo das regiões intrinsecamente desordenadas com detecção e respostas celulares

Estimativa da Sensibilidade Estrutural de Regiões Intrinsecamente Desordenadas em Resposta ao Estresse Hiperosmótico em Células Vivas Utilizando FRET

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

Após a transformação das células de levedura com o plasmídeo pDRFLIP38-AtLEA4-5, a fluorescência dos transformadores positivos foi observada com um transiluminador de luz azul e um filtro (Figura 1). O preparo das diferentes soluções para induzir estresse hiperosmótico é demorado, por isso sugerimos seguir o molde de 96 poços da Figura 2. Imediatamente após o tratamento do estresse hiperosmótico com concentrações variáveis de cloreto de sódio, o...

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Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são domínios proteicos flexíveis que modificam sua conformação em resposta a mudanças ambientais. A transferência de energia por ressonância de fluorescência em conjunto (FRET) pode estimar as dimensões da proteína sob diferentes condições. Apresentamos uma abordagem FRET para avaliar a sensibilidade estrutural da IDR em células vivas de Saccharomyces cerevisiae sob estresse hiperosmótico.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

Nosso objetivo é entender como regiões intrinsecamente desordenadas sentem e respondem a mudanças nas propriedades físico-químicas do ambiente. Combinamos técnicas biofísicas, bioquímicas, genéticas e de biologia celular para monitorar como o conjunto estrutural de regiões desordenadas muda nas células vivas. Técnicas de biofísica de proteínas são atualmente utilizadas para estudar a confirmação de IVRs.Estes incluem ressonância magnética nuclear, dicroísmo circular, espalhamento de raios X a baixos ângulos e FRET. A maioria dessas técnicas só pode ser usada in vitro. Estudar a confirmação de IVRs em um contexto celular é um desafio, com técnicas de alto custo e demoradas.Oferecemos uma alternativa para superar esses desafios. Nosso protocolo pode monitorar a confirmação de IVRs de forma fácil, rápida e reprodutível, complementando outros métodos in vitro. Nossos resultados ofereceram uma compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à sensibilidade estrutural de IVRs sob estresse.Isso permite o uso de IVRs como biossensores somáticos. O rastreamento preciso do ambiente celular contribuirá para uma compreensão mais matizada dos processos fundamentais da vida. Nossa pesquisa levou a questões sobre os determinantes de uma sensibilidade estrutural em regiões intrinsecamente desordenadas, sua relevância para as funções da URA e os fatores ambientais que influenciam essa sensibilidade.

estimation-structural-sensitivity-intrinsically-disordered-regions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

629 visualizações.  Universidad Nacional Autónoma de México. Nosso objetivo é entender como regiões intrinsecamente desordenadas sentem e respondem a mudanças nas propriedades físico-químicas do ambiente. Combinamos técnicas biofísicas, bioquímicas, genéticas e de biologia celular para monitorar como o conjunto estrutural de regiões desordenadas muda nas células vivas. Técnicas de biofísica de proteínas são atualmente utilizadas para estudar a confirmação de IVRs.Estes incluem ressonância magnética nuclear, dicroísmo circular...

Vídeo: Autor em destaque: Desbloqueando o mundo das regiões intrinsecamente desordenadas com detecção e respostas celulares

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.