A concessão SNSF 310030_219210 para J.H.N. apoiou a publicação deste manuscrito sem restrições. A Figura 1 foi criada com a ajuda de BioRender.com.

Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Noroeste e Central da Suíça (EKNZ; ID do projeto 2019-00273). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para o uso experimental de biópsias antes do exame endoscópico. Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento celular para organoides esofágicos derivados de pacientes
NOTA: Uma lista dos constituintes do meio para a cultura de organoides esofágicos humanos é fornecida na Tabela 1.
<ol><li>Obtenha as biópsias. NOTA: No presente estudo, duas biópsias de um segmento do esôfago são obtidas durante a esofagogastroduodenoscopia com pinça de biópsia usando um gastroscópio com um canal de trabalho de 2,8 mm.</li>
	<li>Transfira as biópsias para um meio livre de soro de queratinócitos disponível comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). NOTA: As biópsias podem ser armazenadas no gelo por várias horas até o uso.</li>
	<li>Substitua o meio KSFM por 1 mL de Dispase I (10 U / mL) e incube as biópsias por 10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue as biópsias em temperatura ambiente a 300 x g por 2 min.</li>
	<li>Aspire o Dispase usando uma pipeta de 1000 μL sem tocar nas biópsias e no pellet de detritos celulares.</li>
	<li>Enxágue as biópsias com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).</li>
	<li>Centrifugue as biópsias em temperatura ambiente a 300 x g por 2 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL.</li>
	<li>Incubar as biópsias com 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C por 10 min enquanto agita a 800 rpm.</li>
	<li>Execute a interrupção mecânica por pipetagem repetida para cima e para baixo até obter uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Filtrar as células através de um filtro de células de 70 μm utilizando a cabeça do êmbolo de borracha de uma seringa de tuberculina.</li>
	<li>Lave o coador com 2-4 mL de inibidor de tripsina de soja (250 μg/mL).</li>
	<li>Filtre as células através de um filtro de células de 35 μm com uma tampa de encaixe em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.</li>
	<li>Transfira a solução de célula única para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL.</li>
	<li>Ressuspenda as células em 100 μL de meio KSFM.</li>
	<li>Misturar 10 μL de azul de tripano com 10 μL de suspensão celular.</li>
	<li>Conte as células usando um contador de células automatizado.</li>
</ol>2. Cultura organoide derivada do paciente
<ol><li>Adicione 1-2 mL de KSFM à suspensão celular após a contagem.</li>
	<li>Centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL sem perturbar o sedimento celular.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet celular na matriz de hidrogel do extrato de membrana basal (BME) (40 μL de BME por 20.000 células). NOTA: Depois de adicionar o BME, mantenha as células no gelo para evitar a solidificação prematura do BME.</li>
	<li>Corte uma ponta de pipeta de 200 μL para aspirar a mistura viscosa de suspensão de células BME.</li>
	<li>Forme gotículas de 40 μL em uma placa de cultura de células em suspensão pré-aquecida (37 ° C).</li>
	<li>Incubar a placa sem meio durante 20-30 min a 37 °C para garantir a solidificação das gotículas de BME.</li>
	<li>Adicione meio KSFM-C pré-aquecido suplementado com 10 μM de Y27632 (inibidor de ROCK) nos primeiros dois dias de cultivo.</li>
	<li>Substitua o meio por um novo meio KSFM-C (sem Y27632 e +/- citocina de interesse) a cada dois dias.</li>
	<li>Aspire o meio e raspe as gotículas com a ponta da pipeta enquanto adiciona continuamente 1 mL de Dispase II (1,5 U / mL) ao poço.</li>
	<li>Transferir a mistura BME-dispase para um tubo de centrifugação de 15 ml e incubá-la durante 20 min a 37 °C num banho-maria agitado para digerir o BME.</li>
	<li>Centrifugar a 250 x g durante 3 min a 4 °C e aspirar o Dispase II.</li>
	<li>Proceda de acordo com o protocolo da leitura de interesse (por exemplo, isolamento de RNA, isolamento de proteína ou fixação com PFA a 4% para histologia).</li>
</ol>3. Isolamento celular para culturas de interface ar-líquido (LPA) derivadas do paciente
<ol><li>Obtenha as biópsias. Durante a esofagogastroduodenoscopia com gastroscópio com canal de trabalho de 2,8 mm, são realizadas duas biópsias de um segmento do esôfago com pinça de biópsia.</li>
	<li>Coloque as biópsias em meio livre de soro de queratinócitos disponível comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) e armazenar em gelo por várias horas até o uso.</li>
	<li>Troque KSFM por 1 mL de Dispase (10 U/mL). Em seguida, incube as biópsias por 10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue as biópsias em temperatura ambiente a 300 x g por 2 min.</li>
	<li>Remova o Dispase usando uma pipeta de 1000 μL sem tocar nas biópsias e no pellet de detritos celulares.</li>
	<li>Lave as biópsias com 1 mL de DPBS.</li>
	<li>À temperatura ambiente, gire as biópsias a 300 x g por 2 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL.</li>
	<li>Incubar as biópsias em 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C por 10 min e misturar continuamente a 800 rpm durante a incubação.</li>
	<li>Interrompa as biópsias mecanicamente com pipetagem repetida para cima e para baixo até obter uma suspensão unicelular.</li>
	<li>Passe as células dissociadas através de um filtro de células de 70 μm com uma cabeça de êmbolo de borracha de uma seringa de tuberculina e recolha as células em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Lave o filtro com 2-4 mL de inibidor de tripsina de soja (250 μg/mL) para remover as células restantes do filtro.</li>
	<li>Filtre as células com uma tampa de encaixe do filtro de células de 35 μm em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.</li>
	<li>Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue a 300 x g a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante com uma pipeta de 1.000 μL.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet celular em 4 mL de meio KSFM (Ca2+ 0,09 mM), incluindo 10 μM Y27632.</li>
	<li>Transferir as células para um balão de cultura de células T25.</li>
	<li>Para expandir os queratinócitos primários, cultive as células até 60% -80% de confluência por aproximadamente 1 semana. NOTA: A passagem (P)0 forma conglomerados celulares semelhantes a ilhotas e não é uma monocamada. Os queratinócitos primários formam monocamadas a partir de P1.</li>
	<li>Passagem a 60%-80% de confluência e ressemear P1 em 2-3 frascos de cultura de células T25 ou 1-2 T75.</li>
	<li>Passagem P1 novamente quando os queratinócitos formam uma monocamada com 60%-80% de confluência.</li>
</ol>4. Cultura de interface ar-líquido (LPA) derivada do paciente
<ol><li>Semeie queratinócitos primários P2 em inserções transwell para a cultura ALI. NOTA: Semeie 400.000 células em 12 inserções de poço (200.000 queratinócitos por 0,6 cm2) em 500 μL de KSFM (Ca2 + 0,09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE).<ol><li>Semeie 150.000 células em 24 inserções de poços (155.000 queratinócitos por 0,5 cm2) em 100 μL de KSFM (Ca2 + 0,09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE).</li>
		<li>Em alternativa, congelar no meio KSFM (Ca2+ 0,09 mM + 10% DMSO) a -80 °C durante 24 h e depois transferir as células congeladas para azoto líquido para utilização posterior. NOTA: Ao usar frascos congelados, passe mais uma vez após o descongelamento antes de usar as células para a cultura ALI.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione o meio ao poço inferior abaixo da inserção da placa de cultura transwell. NOTA: Para placas de 12 poços: 1,5 mL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Para placas de 24 poços: 600 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).</li>
	<li>Substitua o KSFM de cálcio médio a alto (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) após 2 dias.</li>
	<li>Troque o meio KSFM com alto teor de cálcio a cada dois dias até o dia 7.</li>
	<li>Realize o transporte aéreo no dia 7 aspirando o meio da câmara superior e substituindo o meio na câmara inferior por KSFM com alto teor de cálcio (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) contendo 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL de ácido ascórbico (AA).<ol><li>Opcional: Adicione citocinas de interesse na concentração desejada ao meio.</li>
	</ol></li>
	<li>Troque o meio a cada dois dias até o dia 14.</li>
</ol>5. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)
<ol><li>Esterilize o eletrodo do medidor TEER mergulhando-o em um poço de uma placa de 24 poços com hipoclorito de sódio a 5% por 10-15 min.</li>
	<li>Lave o hipoclorito de sódio a 5% imergindo o eletrodo em 4 poços subsequentes com ddH2O estéril e deixando o eletrodo secar ao ar.</li>
	<li>Defina o branco colocando um eletrodo no poço e o segundo eletrodo no inserto do poço trans, preenchendo-o com PBS e medindo o TEER. NOTA: Volumes recomendados para medições TEER: Para placa de 12 poços (1900 μL no poço e 900 μL no inserto). Para placa de 24 poços (750-1000 μL no poço e 250 μL no inserto).</li>
	<li>Substitua o meio das culturas ALI por PBS estéril à temperatura ambiente. NOTA: Remova o meio do poço inferior e, em uma segunda etapa, do inserto do transpoço. Da mesma forma, adicione PBS primeiro ao inserto e depois ao poço inferior para evitar o descolamento da cultura ALI da membrana transwell.</li>
	<li>Colocar os elétrodos do medidor TEER nos poços experimentais com culturas ALI e realizar a medição TEER1. NOTA: Realize medições TEER a cada dois dias antes que o meio seja trocado.</li>
</ol>6. Fluxo macromolecular
<ol><li>Diluir a solução-mãe de FITC-Dextrano (3-5 kDa) até uma concentração de trabalho de 1 mg/ml. NOTA: Sempre proteja o FITC-Dextran da exposição à luz.</li>
	<li>Preparar uma linha de diluição com uma concentração decrescente de FITC (1000 μg/ml a 0,25 μg/ml) como padrão para a leitura.</li>
	<li>Adicione 500 μL de solução de FITC-dextrano (1 mg / mL) à câmara superior do poço trans e 1,5 mL de meio (+/- citocina de interesse) no compartimento inferior e coloque a placa na incubadora.</li>
	<li>Colete 120 μL de meio do compartimento inferior nos respectivos pontos de tempo (por exemplo, 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min e 180 min).</li>
	<li>Pipete duplicatas (50 μL / poço) de cada ponto de tempo em uma placa de fundo plano transparente preta de 96 poços.</li>
	<li>Excitar o FITC-dextrano a 490 nm e ler a emissão a um comprimento de onda de 520 nm utilizando um leitor de placas.</li>
	<li>Calcule a quantidade de fluxo macromolecular de acordo com o padrão.</li>
</ol>

Human Esophageal Organoids and Air-Liquid Interface Culture Protocols

Os autores não têm nada a divulgar.

Os procedimentos fornecidos permitem o cultivo de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA com altas perspectivas de sucesso. O protocolo organoide foi adaptado do primeiro protocolo publicado relatando a geração de organoides esofágicos humanos26 e de um protocolo publicado recentemente32. Sherill e colegas descreveram o modelo ALI22. Organoides e modelos de cultura de LPA auxiliam-se mutuamente no estudo do impacto de citocinas e outr...

A inflamação esofágica compromete a integridade da barreira epitelial 1,2,3,4,5, como observado na esofagite eosinofílica (EoE), uma doença inflamatória crônica do esôfago dominada por Th26. A EoE foi descrita pela primeira vez na década de 1990 7,8 e é predominantemente induzida por antígenos alimentares 9,10,11,12,13. Os sintomas mais frequentes de EoE na população adulta são disfagia e impactação alimentar14. Em crianças, a EoE geralmente se manifesta com retardo do crescimento, recusa alimentar, vômitos e dor abdominal15. Estudos de associação genômica ampla (GWAS) identificaram genes de risco de EoE envolvidos na integridade da barreira epitelial, movendo o epitélio para o foco da pesquisa de EoE 16,17,18. A transcriptômica da EoE revelou ainda que um processo de diferenciação prejudicado e uma hiperplasia reativa da zona basal causam o comprometimento da função de barreira do epitélio esofágico 3,5,19,20,21,22. A compreensão precoce da EoE como uma doença mediada por Th26 levou à descoberta da IL-13 como um mediador determinante, perturbando a integridade epitelial3 , 4 , 21 , 23 . Sistemas experimentais que permitem a dissecação dos efeitos mediados por citocinas na integridade epitelial do comprometimento da barreira intrínseca por meio da predisposição genética fornecem a possibilidade de estudar a complexa interação entre as células imunes e o epitélio na EoE. Organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido (LPA) têm sido propostos como ferramentas valiosas para analisar a consequência da estimulação de citocinas na integridade epitelial5.
O primeiro protocolo para geração de organoides esofágicos derivados de células-tronco específicas de tecido adulto (ASC) foi estabelecido cinco anos após os primeiros relatos publicados de organoides intestinais em 2009, usando ASCs Lgr5+ intestinais recapitulando o compartimento epitelial do intestino delgado24. DeWard et al. foram pioneiros na geração de organoides a partir de células epiteliais esofágicas murinas25. Em 2018, Kasagi et al. geraram organoides esofágicos humanos a partir da linha celular de epitélio escamoso esofágico humano imortalizada EPC2-hTERT e células primárias derivadas de pacientes26. No mesmo ano, Zhang et al. geraram com sucesso organoides esofágicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Eles delinearam a importância da inibição do TGFβ e da proteína morfogenética óssea (BMP) para o desenvolvimento de células progenitoras esofágicas (EPC) e o papel crucial da sinalização Notch na diferenciação do epitélio escamoso estratificado26,27. Trisno e colegas complementaram essas descobertas identificando o Sox2 como um inibidor de Wnt que direciona o destino do desenvolvimento para a diferenciação esofágica28. Os refinamentos subsequentes de protocolos, composição do meio e condições de cultura aumentaram a taxa de formação de organoides e possibilitaram a subcultura e recuperação de organoides após a criopreservação 26,29,30,31,32. Embora esses organoides sejam ferramentas poderosas para estudar a arquitetura do tecido e a expressão de genes-alvo potenciais após estimulação com citocinas, os organoides esofágicos não oferecerão a possibilidade de medir a resistência transepitelial (TEER) ou o fluxo de macromoléculas como medidas diretas para a integridade da barreira. Conforme descrito anteriormente por Sherrill e colegas22, as culturas ALI que modelam a diferenciação epitelial4 permitem avaliações diretas da integridade epitelial. A combinação de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA é uma ferramenta poderosa para investigar a arquitetura do tecido e a integridade da barreira epitelial na EoE.
Aqui estão os procedimentos com instruções para isolar células viáveis de biópsias esofágicas e estabelecer culturas de organoides esofágicos e ALI que podem ser usados para estudar os efeitos das citocinas na integridade da barreira.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

O epitélio escamoso do esôfago é diretamente exposto ao ambiente, enfrentando continuamente antígenos estranhos, incluindo antígenos alimentares e micróbios. Manter a integridade da barreira epitelial é fundamental para prevenir infecções e evitar a inflamação causada por antígenos inofensivos derivados de alimentos. Este artigo fornece protocolos simplificados para gerar organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido a partir de biópsias de pacientes para estudar o compartimento epitelial do esôfago no contexto da homeostase tecidual e da doença. Esses protocolos foram marcos científicos significativos na última década, descrevendo estruturas tridimensionais semelhantes a órgãos de células primárias derivadas de pacientes, organoides e culturas de interface ar-líquido. Eles oferecem a possibilidade de investigar a função de citocinas específicas, fatores de crescimento e vias de sinalização no epitélio esofágico dentro de uma estrutura tridimensional, mantendo as propriedades fenotípicas e genéticas do doador. Os organoides fornecem informações sobre a microarquitetura tecidual, avaliando o transcriptoma e o proteoma após a estimulação de citocinas. Em contraste, as culturas de interface ar-líquido permitem a avaliação da integridade da barreira epitelial por meio de medições de resistência transepitelial (TEER) ou fluxo de macromoléculas. A combinação desses organoides e culturas de interface ar-líquido é uma ferramenta poderosa para avançar na pesquisa em condições de barreira epitelial esofágica prejudicadas.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica 

Os organoides esofágicos crescerão a partir de células primárias extraídas de biópsias de pacientes de acordo com as instruções do protocolo fornecido, conforme documentado com um microscópio de campo claro invertido (Figura 1). As ASCs epiteliais começam a formar aglomerados de células de maneira auto-organizada nos primeiros dois dias de cultura após a semeadura das células isoladas no extrato da membrana basal, servindo como um andaime. O tamanho e o número de aglomerados de...

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Aqui, é fornecido um protocolo para a cultura de organoides esofágicos humanos e cultura de interface ar-líquido. A cultura de interface ar-líquido dos organoides esofágicos pode ser usada para estudar o impacto das citocinas na barreira epitelial esofágica.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Estamos investigando a fisiopatologia da esofagite eosinofílica e tentando desvendar a cascata inflamatória que induz e promove o processo inflamatório crônico da EOE. A identificação de novos mediadores imunológicos que contribuem para a patogênese da doença centrou-se no comprometimento da barreira epitelial e na aprovação de anticorpos terapêuticos contra esses mediadores imunológicos. Identificamos as citocinas da subfamília IL-20 como mediadores inflamatórios que prejudicam a diferenciação epitelial e a queratinização, resultando em comprometimento da barreira epitelial pela via MAP quinase.

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Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis 

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Digestive System

SCIENTISTS IN ACTION

442 visualizações.  University of Basel. Estamos investigando a fisiopatologia da esofagite eosinofílica e tentando desvendar a cascata inflamatória que induz e promove o processo inflamatório crônico da EOE. A identificação de novos mediadores imunológicos que contribuem para a patogênese da doença centrou-se no comprometimento da barreira epitelial e na aprovação de anticorpos terapêuticos contra esses mediadores imunológicos. Identificamos as citocinas da subfamília IL-20 como mediadores inflamatórios que prejudica...

Vídeo: Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.