Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação de Ciências Naturais de Ningbo (2022J121, 2023J159), projeto-chave da Fundação de Ciências Naturais da cidade de Ningbo (2021J256), Fundação Aberta do Laboratório Estadual de Engenharia Molecular de Polímeros (Universidade de Fudan) (K2024-35) e Laboratório Chave de Medicina de Precisão para Doenças Ateroscleróticas da Província de Zhejiang, China (2022E10026). Obrigado pelo suporte técnico das Instalações Principais, Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Ningbo.

1. Preparação do banho de suspensão de submicrogel κ-carragenina
<ol><li>Prepare 500 mL de banho de suspensão de κ-carragenina (0,35% em peso / vol) adicionando 1,75 g de pó de κ-carragenina em 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) dentro de um frasco de vidro de 1.000 mL.</li>
	<li>Introduzir uma barra de agitação magnética de 70 mm no frasco de vidro para agitar a mistura aquosa. Aperte a tampa da garrafa de vidro e afrouxe-a meia volta.</li>
	<li>Coloque a garrafa de vidro em banho-maria a 70 °C e aqueça-a. Ligue o agitador magnético a uma velocidade de 300 rpm, coloque o frasco e mexa até que o polímero esteja completamente dissolvido.</li>
	<li>Pegue outro frasco de vidro e coloque-o em uma autoclave para esterilização, funcionando a 121 ° C por 30 min.</li>
	<li>Depois que o esterilizador de alta pressão esfriar a 80 °C, remova o frasco do esterilizador e transfira-o para a bancada ultralimpa para manuseio posterior.</li>
	<li>Filtrar a solução de κ-carragenina completamente dissolvida para o frasco de vidro esterilizado utilizando um filtro de 0,22 μm. NOTA: Execute a filtragem rapidamente enquanto a solução estiver quente para evitar que a κ-carragenina esfrie e obstrua o filtro.</li>
	<li>Conservar a solução de κ-carragenina a 4 °C para induzir uma gelificação reticulada de catiões durante 12 h.</li>
	<li>Triturar mecanicamente os hidrogéis de κ-carragenina utilizando um agitador magnético de 60 mm com uma velocidade de agitação de 1200 rpm a 25 °C até que se transforme com sucesso para o estado líquido, demorando cerca de 60 min. NOTA: Armazene os hidrogéis de κ-carragenina entre 25-37 °C para evitar gelificação em baixas temperaturas ou dissolução em altas temperaturas.</li>
</ol>2. Preparação de biotintas compostas de metacrilato de gelatina / fibroína de seda
<ol><li>Prepare biotintas compostas combinando 10% (peso/vol) de metacrilato de gelatina (GelMA) e 6% (peso/vol) de metacrilato de fibroína de seda (SFMA) em solução PBS (pH 7,4). Pese 2,0 g de GelMA e 1,2 g de pós de SFMA separadamente.</li>
	<li>Adicione lentamente os pós em dois tubos de centrífuga de 50 mL. Adicione 10 mL de solução de PBS separadamente nos tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Adicione um agitador magnético de 10 mm a cada um e mexa e aqueça constantemente em banho-maria a 45 °C. Deixe os pós GelMA e SFMA se dissolverem completamente, levando aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Misturar as soluções de GelMA e SFMA num volume igual sob agitação contínua a 45 °C. Filtrar as biotintas compostas utilizando um filtro de poros de 100 μm.</li>
	<li>Esterilize as biotintas compostas GelMA/SFMA por meio de irradiação UV em um gabinete de biossegurança por 12 h. NOTA: Prepare e use as biotintas imediatamente para evitar a gelificação prematura do SFMA por meio da automontagem.</li>
</ol>3. Caracterização reológica do banho de suspensão de κ-carragenina submicrogel
<ol><li>Inicie e prepare equipamentos relacionados à reologia.<ol><li>Ligue o compressor de ar por 30 min e certifique-se de que a pressão atinja 30 psi. Remova o rolamento clamp girando a haste de tração no sentido anti-horário. Fixe a tampa preta abaixo e gire o eixo do botão na parte superior do instrumento no sentido horário.</li>
		<li>Ligue o reômetro e permita que ele inicialize. Ligue o interruptor de circulação de água e deixe a temperatura atingir 15 °C.</li>
		<li>Abra o software de controle do reômetro para estabelecer a conexão online.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibre o reômetro e instale a geometria da placa paralela.<ol><li>Realize a calibração do instrumento no software de controle, que envolve principalmente o ajuste do caminho de inércia do instrumento de calibração. Encaixe uma geometria de placa paralela de 40 mm de diâmetro na extremidade da haste de tração. Segure o botão Lock por 3 s para mover o eixo do motor para a posição inicial para um posicionamento consistente da geometria.</li>
		<li>Selecione o Gerenciador de calibração no software de controle e, em seguida, clique em Inércia, Calibração de atrito e Mapeamento rotacional para calibrar a geometria da placa paralela.</li>
	</ol></li>
	<li>Zere a altura da folga do reômetro realizando um procedimento padrão de zeragem da folga para garantir uma medição precisa.</li>
	<li>Configure as etapas experimentais, incluindo uma rampa de fluxo variando de 0,01 a 1000 1/s de taxa de cisalhamento, uma varredura de amplitude variando de 0,1% a 100% de deformação a 10 rad/s, uma varredura de tempo de oscilação de várias etapas com duração de 60 s com deformações alternadas de 1% e 100% a 10 rad/s e uma varredura de retenção de pico de várias etapas com duração de 120 s com taxa de cisalhamento alternada de 0,1 1/s e 10 1/s.</li>
	<li>Coloque 2 mL de suspensões de κ-carragenina a 0,35% na placa de Peltier do reômetro.</li>
	<li>Posicione a folga da geometria em 510 μm e remova qualquer excesso de transbordamento na borda do dispositivo de fixação. Defina o espaço de amostra para 500 μm para permitir que a amostra se estenda um pouco além da borda do grampo.</li>
	<li>Realize um experimento de fluxo selecionando a Rampa de Fluxo nas opções de projeto experimental.<ol><li>Escolha o teste de rampa de fluxo no projeto experimental. Defina as taxas de cisalhamento de 0.001 a 10 1/s a uma temperatura de 25 °C.</li>
		<li>Execute a etapa 3.5 e o experimento de Rampa de Fluxo na amostra adicionada.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize um teste cíclico de Peak Hold para avaliar o desempenho de recuperação do material.<ol><li>Escolha a varredura Peak Hold no projeto experimental e defina 5 experimentos consecutivos com um tempo de 120 s a 25 °C.</li>
		<li>Defina a taxa de cisalhamento para 0,01 1/s para o primeiro, terceiro e quinto passos e para 10 1/s para o segundo e quarto passos.</li>
		<li>Adicione uma nova amostra de 2 mL. Execute a etapa 3.5 e o teste de recuperação cíclica.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a análise de viscoelasticidade para avaliar a potencial transição gel-sol do banho de suspensão κ-carragenina.<ol><li>Escolha o teste de varredura de amplitude no projeto experimental. Defina a tensão de oscilação de 0,1% a 100% a uma temperatura de 25 °C. Clique em Iniciar para executar o experimento de varredura de amplitude na amostra adicionada.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize análises de deformação alternativas para avaliar o desempenho de recuperação elástica do material.<ol><li>Escolha Oscillation Time Sweep no projeto experimental e defina 5 experimentos consecutivos com um tempo de 60 s a 25 °C.</li>
		<li>Defina a tensão para 1% para a primeira, terceira e quinta etapas e para 100% para a segunda e quarta etapas.</li>
		<li>Adicione uma nova amostra de 2 mL. Execute a etapa 3.5 e o teste de recuperação cíclica contínua. NOTA: Limpe a placa de geometria e a placa de Peltier após cada teste de experimento e adicione uma nova amostra de 2 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Impressão de andaimes de hidrogel biomiméticos usando uma bioimpressora de microextrusão personalizada
<ol><li>Projete cubos no formato STL usando um software gráfico 3D e baixe modelos semelhantes a tecidos do banco de dados 3D (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).<ol><li>Importe os modelos no formato STL para o software PANGO e insira os parâmetros de impressão. Defina as coordenadas X, Y e Z específicas do modelo no espaço 3D, insira o tamanho de escala esperado do modelo em milímetros (mm), ajuste o tamanho e a taxa de escala do objeto nos eixos X, Y e Z e ajuste o ângulo de rotação do modelo no espaço conforme necessário.</li>
		<li>Insira o diâmetro estimado do filamento (normalmente em torno de 200-500 μm para a maioria das biotintas) no campo de espessura da camada para determinar a espessura do eixo Z de cada camada. Defina a velocidade de impressão de acordo com a espessura da linha esperada (aproximadamente 10-90 mm/s) e defina a densidade de preenchimento para 30%-80%.</li>
		<li>Exporte os parâmetros finais como código G para um cartão SD.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute a bioimpressora e a bomba de microextrusão.<ol><li>Ligue o controlador da bomba de microextrusão, selecione a seringa de volume correspondente (5 mL) e defina a taxa de extrusão em 0.08 mL/min e a duração da extrusão em coordenação com o tempo de impressão desejado obtido dividindo o volume de hidrogel pela taxa de extrusão.</li>
		<li>Encaixe a seringa com uma agulha com um diâmetro interno de 210 μm no slot da seringa da bioimpressora.</li>
		<li>Ajuste o controlador da seringa para garantir que o êmbolo da seringa esteja em contato próximo com o parafuso.</li>
		<li>Colocar 3 ml de banho de suspensão numa placa de cultura celular de 35 mm. Posicione o prato na plataforma com base nas configurações de código e confirme se o cabeçote de impressão está 1 mm acima do fundo do prato. NOTA: Realize um pré-teste para garantir a precisão das posições dos pratos na plataforma de impressão durante a impressão.</li>
		<li>Insira o cartão SD que contém o código na bioimpressora 3D, ative o código file, inicie a bioimpressora e clique no botão Iniciar no controlador.</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento dos construtos<ol><li>Exponha a construção impressa à luz azul de 405 nm por 1 min para iniciar a fotoreticulação.</li>
		<li>Remover o gel de κ-carragenina com uma pipeta de 1 ml, seguido da adição de 3 ml de PBS (pH 7,4) para lavagem e posterior remoção. Repita este processo para uma lavagem completa. NOTA: Execute o processo de lavagem com cuidado para evitar danificar as construções impressas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bioimpressão 3D incorporada de análogos da camada muscular esofágica
<ol><li>Cultura de células musculares lisas esofágicas de coelhos (eSMCs).<ol><li>Iniciar a cultura em frascos T75 com 2 x 106 células usando 15 mL de meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Mantenha os eSMCs a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar até atingirem 80% de confluência.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de bioink da camada muscular esofágica<ol><li>Aspire o meio ao atingir a confluência e lave os eSMCs com 5 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,2% ao frasco e incube por 2 min para digerir as células. Bata no frasco para separar as células da parede.</li>
		<li>Termine a digestão adicionando 2 mL de DMEM e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL. Meça a densidade celular usando um contador de células com 10 μL de suspensão celular.</li>
		<li>Centrifugue a 675 x g durante 3 min, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular nas biotintas compostas GelMA/SFMA (conforme preparado no passo 2.1). Ajuste a concentração final da célula para atingir uma densidade de 10 x 106 células/mL na bioink, otimizando assim as condições para aplicações subsequentes de bioimpressão 3D.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da bioimpressora 3D e materiais associados<ol><li>Autoclave os instrumentos de impressão essenciais, incluindo agulhas de seringa, fórceps, um agitador magnético e um frasco de vidro de silicato de 1000 mL, sob condições de esterilização padrão (121 °C por 30 min) para garantir um ambiente asséptico para o processo de impressão.</li>
		<li>Coloque a bioimpressora dentro de um gabinete de biossegurança e esterilize-a com luz ultravioleta (UV) por um período de 30 min para manter a esterilidade.</li>
		<li>Prepare 50 mL de κ-carragenina estéril e 5 mL de biotintas compostas estéreis GelMA / SFMA, conforme descrito na etapa 1 e na etapa 2, respectivamente.</li>
		<li>Projete o modelo, defina os parâmetros desejados e prepare a bioimpressora conforme descrito na etapa 4.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Início do processo de bioimpressão<ol><li>Execute os procedimentos descritos nas etapas 4.2 e 4.3 para bioimprimir a camada muscular esofágica 3D, seguida de lavagem e substituição do PBS.</li>
		<li>Realize a impressão celular com técnicas estéreis durante todo o processo de impressão para minimizar o risco de contaminação celular na estrutura impressa.</li>
	</ol></li>
	<li>Substituição do meio de cultura de células pós-impressão<ol><li>Aspire cuidadosamente o PBS e substitua-o por 3 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina. Certifique-se de que as construções impressas estejam totalmente submersas para fornecer condições ideais de crescimento celular.</li>
		<li>Incubar a placa de cultura de células contendo as construções impressas numa incubadora regulada para 37 °C com 5% de CO2. Substitua o meio de cultura celular por meio fresco diariamente, usando 3 mL de cada vez, e monitore o estado das células dentro das construções usando microscopia de luz.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Avaliação da viabilidade de eSMCs dentro das construções impressas via coloração de ensaio Vivo / Morto
<ol><li>Remover o meio de cultura celular após 5 h de incubação e lavar as construções carregadas de células com PBS.</li>
	<li>Adicione 2 mL da solução padrão de calceína-AM/iodeto de propídio (1:1000) às construções impressas carregadas de células e incuba.</li>
	<li>Lave as construções 3x com PBS após uma incubação de 45 minutos e, em seguida, adicione meio de cultura de células frescas.</li>
	<li>Observe células vivas e mortas e capture imagens fluorescentes usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).</li>
</ol>7. Observação dos eSMCs dentro das construções impressas via coloração FITC-Faloidin/DAPI
<ol><li>Pintar as construções impressas usando isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado com faloidina (verde) para F-actina e 4',6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) para nuclear após 5 dias de incubação.</li>
	<li>Preparação da solução de fixação<ol><li>Combine 4 mL de 1x PBS com 0,16 mL de paraformaldeído (PFA) em um tubo de polietileno (PE) de 5 mL, atingindo uma concentração final de 4%.</li>
		<li>Coloque a placa de cultura contendo as construções bioimpressas em uma superfície limpa. Remova o meio e cubra suavemente as construções com a solução PFA, garantindo sua imersão total. Deixe a fixação prosseguir à temperatura ambiente por 20 minutos antes de descartar a solução. NOTA: Manuseie líquidos com cuidado durante os processos de adição e remoção para preservar a integridade estrutural das construções bioimpressas.</li>
		<li>Introduza 2,5 mL de 1x PBS na placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover quaisquer reagentes de coloração residuais.</li>
	</ol></li>
	<li>Permeabilização da membrana celular<ol><li>Formule uma solução de Triton X-100 a 0,5% adicionando 20 μL de Triton X-100 a 4 mL de 1x PBS em um tubo de PE de 5 mL.</li>
		<li>Administre a solução Triton X-100 nas construções por 30 min em temperatura ambiente para permear as membranas celulares e, em seguida, remova a solução.</li>
		<li>Introduza 2,5 mL de 1x PBS na placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover quaisquer reagentes de coloração residuais.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueando a associação não específica<ol><li>Crie uma solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 3% em um tubo de PE de 5 mL adicionando 0,12 mL de BSA a 4 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Introduza a solução BSA nas construções por 30 minutos em temperatura ambiente para bloquear locais não específicos e, em seguida, descarte a solução.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração de actina com FITC-Faloidina<ol><li>Prepare a solução de FITC-faloidina a 0,2% em um tubo PE de 5 mL com 4 mL de 1x PBS e 8 μL de reagente de coloração.</li>
		<li>Mergulhe as construções nesta solução por 60 min em temperatura ambiente no escuro e depois descarte a solução.</li>
		<li>Adicione 2,5 mL de 1x PBS à placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover os reagentes de coloração residuais.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração nuclear com DAPI<ol><li>Aplique 4 mL de solução de coloração DAPI nas construções, garantindo uma cobertura completa.</li>
		<li>Incube no escuro à temperatura ambiente por 20 min antes de remover a solução de DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavagem final e submersão de PBS: Adicione 2,5 mL de 1x PBS à placa de cultura, submergindo totalmente as construções para remover os reagentes de coloração residuais. NOTA: Prepare as soluções de coloração com antecedência e manuseie-as com cuidado. Em nenhum momento as células devem sofrer dessecação dentro do vaso de cultura.</li>
	<li>Observe usando um microscópio confocal: Inspecione e visualize as construções coradas usando microscopia confocal para avaliar o crescimento celular, garantindo uma documentação abrangente dos resultados.</li>
</ol>8. Avaliação da proliferação de eSMCs dentro dos construtos impressos usando o ensaio CCK-8
<ol><li>Remova o meio de cultura das construções nos dias 7 e 14. Lave as construções com PBS para remover o meio residual e as células destacadas.</li>
	<li>Adicione a solução CCK-8 a cada construção seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que o volume da solução CCK-8 seja adequado para cobrir cada construção completamente.</li>
	<li>Incubar as construções com a solução CCK-8 a 37 °C durante 2 h. Após a incubação, transfira cuidadosamente o sobrenadante para uma nova placa de 96 poços.</li>
	<li>Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.</li>
</ol>

Avançando na bioimpressão 3D com meio submicrogel κ-carragenina

<ol>
	<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+engineered+fiber+scaffolds+fabricated+by+electrospinning+for+periodontal+tissue+regeneration.">Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration.</a> J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).</li><li>Amann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+graded,+porous+composite+of+natural+biopolymers+and+octacalcium+phosphate+guides+osteochondral+differentiation+of+stem+cells.">A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells.</a> Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).</li><li>Afjoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-gelled+alginate/gelatin+scaffolds+for+wound+healing+applications:+An+in+vitro,+in+vivo+study.">Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study.</a> Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).</li><li>Hasanzadeh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+tissue-engineered+scaffold+polymers+for+3D+printing+and+its+application+for+4D+printing.">Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing.</a> Chem Eng J. 476, 146616 (2023).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-like+protein+hydrogels+engineered+via+entanglement.">Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement.</a> Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).</li><li>Bertsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration.">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li><li>Hinton, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+fluid+gels+formed+by+shear+processing+during+gelation+for+suspended+3d+bioprinting.">Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting.</a> J Vis Exp. (195), e64458 (2023).</li><li>Roche, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=durability,+contractility+and+vascular+network+formation+in+3d+bioprinted+cardiac+endothelial+cells+using+alginate-gelatin+hydrogels.">durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels.</a> Front Bioeng Biotech. 9, 63657 (2021).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bioprinting+of+tough+hydrogel-based+vascular+conduits+for+functional+blood+vessels.">Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels.</a> Sci Adv. 8 (43), (2022).</li><li>Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-shear+bioprinting+of+highly+oriented+porous+hydrogel+microfibers+to+construct+anisotropic+tissues.">Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues.</a> Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).</li></ol>

Os autores não têm interesse financeiro nos produtos descritos neste manuscrito.

A preparação de banhos de suspensão de submicrogel de κ-carragenina para uso em bioimpressão é um processo cuidadosamente orquestrado que envolve várias etapas críticas para garantir que o meio resultante exiba as propriedades desejadas para suportar biotintas. Inicialmente, uma solução de κ-carragenina é preparada dissolvendo o pó de κ-carragenina em água deionizada a temperaturas elevadas, criando uma mistura homogênea. A conc...

Os andaimes de engenharia de tecidos, incluindo fibras eletrofiadas, esponjas porosas e hidrogéis poliméricos, desempenham um papel fundamental no reparo e reconstrução de tecidos e órgãos danificados, fornecendo uma estrutura estrutural que apoia o crescimento celular, a regeneração de tecidos e a restauração da função do órgão 1,2,3. No entanto, os andaimes tradicionais encontram desafios na replicação precisa das estruturas de tecidos nativos, levando a uma incompatibilidade entre os tecidos projetados e naturais. Essa limitação dificulta a cicatrização eficiente de tecidos defeituosos, enfatizando a necessidade urgente de avanços no design de andaimes para obter uma biomimética mais precisa. A bioimpressão tridimensional (3D) é uma técnica de fabricação inovadora que constrói com precisão estruturas complexas de tecidos biológicos camada por camada usando tintas e células de biomateriais4. Entre vários biomateriais, os hidrogéis poliméricos surgem como biotintas ideais com sua rede distinta que facilita o encapsulamento in situ das células e auxilia crucialmente seu crescimento 5,6. No entanto, muitos hidrogéis macios e altamente hidratados tendem a induzir o desfoque ou o rápido colapso das estruturas de andaimes impressas durante o processo de impressão quando usados como biotintas. Para enfrentar esse desafio, a tecnologia de bioimpressão 3D incorporada emprega um banho de microgel como material de suporte, permitindo a deposição precisa de biotinta macia. Após a gelificação das biotintas de hidrogel, andaimes biônicos refinados com estruturas intrincadas são obtidos removendo o banho de microgel. Materiais como gelatina 7,8, agarose9 e goma gelana10,11 foram empregados para criar banhos de microgel para bioimpressão 3D incorporada, avançando significativamente a aplicação de hidrogéis macios na engenharia de tecidos. No entanto, o tamanho de partícula não uniforme e em nível de mícron desses géis particulados afeta negativamente a resolução e a fidelidade da impressão 3D 12,13,14. Há uma necessidade urgente de fabricar um flutuador de suspensão semelhante a gel com partículas pequenas e uniformemente dispersas, oferecendo vantagens na obtenção de bioimpressão de alta fidelidade.
Neste protocolo, um novo banho de suspensão de κ-carragenina granulado sacrificial com um nível uniforme de submícrons é apresentado para impressão 3D incorporada. Este comportamento inovador de banho de submicrogel de transição rápida de interferência-desobstrução facilita a fabricação precisa de andaimes de hidrogel biomiméticos com alta fidelidade estrutural15. Utilizando este novo meio de suspensão, uma série de tecidos biomiméticos e construções de órgãos com estruturas de tecido multicamadas são impressas com sucesso, empregando uma biotinta composta de metacrilato de gelatina e fibrometacrilato de seda. Neste estudo, escolhemos o esôfago como objeto biomimético de bioimpressão 3D principalmente porque o esôfago não apenas possui uma estrutura de tecido multicamadas, mas também sua camada muscular exibe uma estrutura de camadas complexas circulares circulares internas e longitudinais externas. Garantir o alinhamento e a organização adequados dessas camadas é essencial para a regeneração funcional do tecido. Portanto, desejamos muito replicar a arquitetura multicamadas do esôfago. Mais importante, utilizamos submicrogéis de κ-carragenina como banho de suspensão e GelMA / SFMA como biotinta para projetar e construir um andaime biomimético para engenharia de tecidos. O esôfago impresso pode ser facilmente liberado por lavagem salina tamponada com fosfato repetida. Além disso, o banho de κ-carragenina submicrogel é isento de substâncias citotóxicas, garantindo alta citocompatibilidade15. As células musculares lisas carregadas dentro de andaimes anisotrópicos exibem uma notável atividade de disseminação. Este meio de suspensão submicrogel uniforme oferece um novo caminho para a fabricação de tecidos e órgãos complexos por meio de bioimpressão 3D incorporada.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D bioprinter</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>C0065</td>
			<td>Ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm UV light</td>
			<td>EFL</td>
			<td>XY-WJ01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cyto smart 6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>STELLARIS 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3113-0500</td>
			<td>High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic rotational rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td>Discovery HR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esophageal smooth muscle cells</td>
			<td>Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University</td>
			<td></td>
			<td>Primary cells from the rabbit esophagus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>UE</td>
			<td>F9070L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>CA1610</td>
			<td>300T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-GM-60</td>
			<td>60% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-carrageenan</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>C121013-100g</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>L157759-1g</td>
			<td>365~405 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Dead kit</td>
			<td>beyotime</td>
			<td>C2015M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Potenov</td>
			<td>PT-3502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1110&#160;</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>100 &#180;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3580-0500</td>
			<td>pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-SilMA-001</td>
			<td>39% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C100C1</td>
			<td>0.25%, without phenol red</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embedded bioprinting of tissue-like structures using &#954;-carrageenan sub-microgel medium

A bioimpressão tridimensional (3D) incorporada utilizando um banho de suporte de hidrogel granular surgiu como uma técnica crítica para a criação de andaimes biomiméticos. No entanto, a engenharia de um meio de suspensão de gel adequado que equilibre a deposição precisa de bioink com a viabilidade e função celular apresenta vários desafios, particularmente na obtenção das propriedades viscoelásticas desejadas. Aqui, um novo banho de suporte de gel de κ-carragenina é fabricado por meio de um processo de moagem mecânica fácil de operar, produzindo partículas homogêneas em submicroescala. Esses submicrogéis exibem comportamento típico de fluxo de Bingham com pequena tensão de escoamento e propriedades de afinamento rápido por cisalhamento, que facilitam a deposição suave de bioinks. Além disso, a transição gel-sol reversível e as capacidades de autocura da rede de microgel κ-carragenina garantem a integridade estrutural das construções impressas, permitindo a criação de estruturas de tecido complexas e multicamadas com características arquitetônicas definidas. Após a impressão, os submicrogéis de κ-carragenina podem ser facilmente removidos por uma simples lavagem salina tamponada com fosfato. A bioimpressão adicional com biotintas carregadas de células demonstra que as células dentro das construções biomiméticas têm uma alta viabilidade de 92% e estendem rapidamente os pseudópodes, além de manter uma proliferação robusta, indicando o potencial dessa estratégia de bioimpressão para a fabricação de tecidos e órgãos. Em resumo, este novo meio submicrogel de κ-carragenina surge como um caminho promissor para a bioimpressão incorporada de qualidade excepcional, com profundas implicações para o desenvolvimento in vitro de tecidos e órgãos projetados.

Tissue engineering scaffolds, including electro-spun fibers, porous sponges, and polymer hydrogels, play a pivotal role in the repair and reconstruction of damaged tissues and organs by providing a structural framework supporting cell growth, tissue regeneration, and the restoration of organ function1,2,3. However, traditional scaffolds encounter challenges in accurately replicating native tissue structures, leading to a mismatch between the engineered and natural tissues. This limitation hinders the efficient healing of defective tissues, emphasizing the urgent need for scaffold design advancements to achieve more accurate biomimicry. Three-dimensional (3D) bioprinting is an innovative manufacturing technique that precisely constructs complex biological tissue structures layer by layer using biomaterial inks and cells4. Among various biomaterials, polymer hydrogels emerge as ideal bioinks with their distinctive network that facilitates in situ encapsulation of cells and crucially supports their growth5,6. Nevertheless, many soft and highly hydrated hydrogels tend to induce blurring or rapid collapse of printed scaffold structures during the printing process when used as bioinks. To address this challenge, embedded 3D bioprinting technology employs a microgel bath as a support material, allowing precise soft bioink deposition. Upon gelation of the hydrogel bioinks, refined bionic scaffolds with intricate structures are obtained by removing the microgel bath. Materials like gelatin7,8, agarose9, and gellan gum10,11 have been employed to create microgel baths for embedded 3D bioprinting, significantly advancing the application of soft hydrogels in tissue engineering. However, the micron-level and non-uniform particle size of these particulate gels detrimentally impacts the resolution and fidelity of 3D printing12,13,14. There is an urgent need to fabricate a gel-like suspension float with small and uniformly dispersed particles, offering advantages in achieving high-fidelity bioprinting.
In this protocol, a novel sacrificial granulate &#954;-carrageenan suspension bath with a uniform sub-micron level is presented for embedded 3D printing. This innovative sub-microgel bath behavior of rapid jamming-unjamming transition facilitates the precise fabrication of biomimetic hydrogel scaffolds with high structural fidelity15. Utilizing this new suspension medium, a series of biomimetic tissue and organ constructs featuring multi-layer tissue structures are successfully printed, employing a composite bioink composed of gelatin methacrylate and silk fibro methacrylate. In this study, we chose the esophagus as the 3D bioprinting biomimetic object mainly because the esophagus not only has a multi-layered tissue structure but also its muscle layer exhibits an internal circular and external longitudinal complex layering structure. Ensuring proper alignment and organization of these layers is essential for functional tissue regeneration. Therefore, we highly desire to replicate the multilayered architecture of the esophagus. More importantly, we utilized &#954;-carrageenan sub-microgels as the suspension bath and GelMA/SFMA as the bioink to design and construct a biomimetic scaffold for tissue engineering. The printed esophagus can be easily released by repeated phosphate-buffered saline washing. Moreover, the &#954;-carrageenan sub-microgel bath is free of cytotoxic substances, ensuring high cytocompatibility15. The smooth muscle cells loaded within anisotropic scaffolds exhibit a notable spreading activity. This uniform sub-microgel suspension medium offers a new avenue for the fabrication of complex tissues and organs through embedded 3D bioprinting.

Autor em destaque: Desenvolvimento de banhos homogêneos de submicrogel de κ-carragenina para bioimpressão 3D de alta resolução

Bioimpressão Incorporada de Estruturas Semelhantes a Tecidos Usando Meio Submicrogel κ-Carragenana

3D bioprinting in a microgel-based suspension bath has provided a versatile platform for fabricating complex 3D structures using soft hydrogels, but it is still limited by the low print resolution and accuracy, hindering the practical applications of the printed products in tissue engineering. The present microgel baths often exhibit large sizes and poor dispersions, resulting in a big diameter and irregular morphology of the printed filaments. Therefore, it poses a significant challenge in preparing a microgel bath with a small particle size and uniform morphology.This protocol offers the fabrication of a homogenous and biocompatible cationic cross-linked kappa-carrageenan sub-microgel bath for high-fidelity bioprinting, through an easy-to-operate mechanical grinding strategy, Since kappa-carrageenan sub-microgels exhibit a uniform methodology with a small particle size of 565 nanometer, and a low state of 0.35%enabling precise tissue and organ construction with remarkable fidelity and high resolution.

O banho de gel granular de κ-carragenina foi gerado pela quebra mecânica dos hidrogéis a granel em uma pasta de gel particulado. O estudo mais recente demonstrou que as partículas de κ-carragenina exibiram um diâmetro médio de aproximadamente 642 ± 65 nm com morfologias uniformes a 1000 rpm de mistura mecânica15, significativamente menores do que as dimensões dos microgéis previamente relatadas na literatura 16,17,18...

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Este estudo apresenta um novo banho de suspensão de submicrogel de κ-carragenina, exibindo notáveis propriedades reversíveis de transição de interferência-desobstrução. Esses atributos contribuem para a construção de tecidos e órgãos biomiméticos em bioimpressão 3D embarcada. A impressão bem-sucedida de tecidos semelhantes ao coração/esôfago com alta resolução e crescimento celular demonstra aplicações de bioimpressão e engenharia de tecidos de alta qualidade.

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

embedded-bioprinting-tissue-like-structures-using-carrageenan-sub

Research

JoVE Journal

Engineering

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

562 visualizações.  Ningbo University. A bioimpressão 3D em um banho de suspensão à base de microgel forneceu uma plataforma versátil para a fabricação de estruturas 3D complexas usando hidrogéis macios, mas ainda é limitada pela baixa resolução e precisão de impressão, dificultando as aplicações práticas dos produtos impressos na engenharia de tecidos. Os banhos de microgel presentes geralmente exibem tamanhos grandes e dispersões pobres, resultando em um grande diâmetro e morfol...