Name: sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
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Antes de iniciar o ensaio, precisamos ter certeza de que os seguintes reagentes são corretamente preparado: <ol><li> Um tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7.5. Prepare com 11,4 mg / ml de fosfato de potássio dibásico, tri-hidratado em água purificada e ajustar o pH com HCl 1M. Esta solução é colocada a 37 ° C antes do uso. </li><li> Uma solução de caseína de 0,65% peso / volume, preparada pela mistura de 6,5 mg / ml de caseína no tampão fosfato 50 mM de potássio. Aumentou gradualmente a temperatura da solução, com agitação suave para 80-85 ° C por aproximadamente 10 minutos até que uma dispersão homogênea é alcançado. É muito importante não ferver a solução. O pH é ajustado se necessário, com NaOH e HCl. </li><li> A 110 mM Solução de ácido tricloroacético, preparada diluindo-se um estoque 6.1N 1:55 com água purificada. Ácido tricloroacético é um ácido forte e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> 0,5 mM Folin &amp; Ciolcaltea, ou reagente fenol Folin, que é a solução que irá reagir com a tirosina para gerar uma mudança de cor mensuráveis ​​que estará diretamente relacionada à atividade de proteases. Reagente Fenol Folin é um ácido e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> A 500 mM solução de carbonato de sódio é preparada com 53 mg / ml de carbonato de sódio anyhydrous em água purificada. Uma solução diluente enzima, que consiste em 10 mM tampão acetato de sódio com acetato de cálcio 5mM, pH 7,5, a 37 ° C. Esta solução é o que usamos para dissolver amostras protease sólido ou soluções diluídas da enzima. </li><li> 1,1 mM L-tirosina solução estoque padrão. Preparados com 0,2 mg / ml L-tirosina em água purificada e aquecida suavemente até a tirosina se dissolve. Tal como acontece com a caseína, não ferver esta solução. Permitir que o padrão L-tirosina para esfriar a temperatura ambiente. Esta solução será diluída mais para tornar a nossa curva padrão. </li><li> Solução de protease. Imediatamente antes de usar, dissolver em solução diluente protease enzima preparada no passo 6. </li></ol> Se necessário, use uma amostra sólida protease de atividade pré-determinada, que é dissolvido utilizando diluente enzima para 0,1-0,2 unidades / ml. Esta solução serve como um controle positivo para o ensaio controle de qualidade e como validação para os cálculos vamos realizar para determinar a atividade da enzima. Configurando o Ensaio Protease e Curvas Padrão <ol><li> Para começar este ensaio, encontrar frascos adequados que irá realizar cerca de 15 mls. Para cada enzima que será testado, 4 frascos são necessários. Um frasco será usado como um espaço em branco, e outros três serão utilizados para a atividade de ensaio de três diluições da protease. Três diluições são úteis ao verificar cálculos finais uns contra os outros. <ol><li> Para cada conjunto de quatro frascos, adicione 5mls da nossa solução de caseína de 0,65%. Deixe que eles se equilibram em banho-maria a 37 ° C por aproximadamente 5 minutos. </li><li> Adicionar variados volumes de solução de enzima que será testado para três dos frascos de amostra de teste, mas não o branco. Mix agitando e incubar por 37 ° C por exatamente 10 minutos. A atividade de protease e libertação conseqüentes de tirosina durante este tempo de incubação é o que vai ser medido e comparado entre as amostras de teste. </li></ol></li><li> Após esta incubação 10 minutos, adicione o 5 mls do reagente TCA a cada tubo para parar a reação. Em seguida, adicione um volume adequado de solução de enzima a cada tubo, mesmo em branco, para que o volume final da solução de enzima em cada tubo é de 1 ml. Isto é feito para dar conta do valor da absorbância da enzima em si e para garantir que o volume final em cada tubo é igual. Incubar as soluções a 37 ° C por 30 minutos. Durante esta incubação de 30 minutos, você pode querer configurar seu tirosina diluições padrão. Use dram 6 frascos (frascos dram pode ser substituído por tubos de polipropileno) que pode facilmente prender 8 mls. Aos seis frascos, adicione a 1,1 mM tirosina soluções estoque padrão com os seguintes volumes em mls: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Não adicione qualquer padrão de tirosina para o branco. Padrões mais baixos pode ser necessária para amostras impuras que trará mudança de cor pouco. Uma vez que a solução padrão de tirosina foi adicionado, adicione um volume adequado de água purificada a cada um dos padrões para obter um volume de 2 mls. </li><li> Após a incubação de 30 minutos, filtrar cada uma das soluções de teste e os em branco usando uma seringa de 0,45 polietersulfona filtro. Filtração é necessária para remover qualquer insolúveis das amostras. <ol><li> Adicionar a filtração 2 mls das amostras teste e filtrado em branco para 4 frascos dram que pode conter pelo menos 8 mls. O mesmo tipo de frasco nas quais as normas foram elaboradas podem ser usados. </li><li> A todos os frascos contendo as normas e padrão em branco, adicione 5mls de carbonato de sódio. Para melhores resultados, adicionar 1 ml de reagente de Folin imediatamente depois. </li><li> Adicionar carbonato de sódio para regular qualquer queda pH criado pela adição de reagente de Folin o. </li><li> Adicionar carbonato de sódio, as amostras de teste e test em branco. Essas soluções tornam-se nublado, após a adição de carbonato de sódio. Adicionar o reagente Folin, que vai reagir principalmente com tirosina livre. </li><li> Misture os frascos dram por agitação e incubar a 37 ° C por 30 minutos. </li></ol> Após esta incubação, você deve observar que os padrões têm uma gradação de cor correlacionando-se com a quantidade de tirosina acrescentado; as maiores concentrações de tirosina mais escura aparecendo. Você pode notar também mudam de cor em amostras apreciável nosso teste. 2mls destas soluções são filtradas usando uma seringa de 0,45 polietersulfona filtro em cuvetes adequado. Agora que o ensaio é realizado, você pode avançar para o espectrofotômetro para gravar os nossos valores de absorbância. </li></ol> Medição de absorbância e Calculando Atividade Enzimática <ol><li> A absorbância das amostras é medida por um espectrofotômetro usando um comprimento de onda de 660 nm. O caminho da luz é definida como um centímetro. Registrar os valores de absorbância para os padrões, em branco padrão, as amostras de teste diferentes, e ensaio em branco. Depois de todos os dados tenham sido coletados, a curva padrão pode ser criado. , A fim de gerar a curva de diferença, em absorbância entre o branco ea norma deve ser calculado. Este é o valor de absorbância atribuível à quantidade de tirosina nas soluções padrão. Após esse cálculo simples, criar a curva padrão, utilizando um programa gráfico para plotar a variação da absorvância de nossos padrões no eixo Y, em relação ao montante em micromoles para cada um dos nossos 5 normas sobre o eixo X. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume de padrão de tirosina </th><th style="text-align:center"> Tirosina uMoles </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Depois de pontos de dados foram inseridos, geram uma linha de melhor ajuste e inclinação equação correspondente. Encontrar a variação de absorvância das amostras de teste através do cálculo da diferença entre a absorbância da amostra de teste ea absorbância do ensaio em branco. Inserindo o valor de absorbância para uma das amostras na equação inclinação e resolução resultará na micromoles de tirosina liberada durante esta reação proteolítica particular. Para obter a atividade da enzima em unidades por / ml, executar o seguinte cálculo: (Umole equivalentes tirosina liberada) x (11) Unidades / ml = Enzyme __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = volume total (em mililitros) de ensaio 10 = Tempo de ensaio (em minutos) de acordo com a definição da Unidade 1 = Volume da enzima (em mililitros) de enzima usada 2 = Volume (em mililitros) utilizados na determinação colorimétrica Tome o número de equivalentes micromoles tirosina liberados obtidos a partir da equação inclinação e multiplicá-lo pelo volume total do ensaio em mls, que no nosso caso é 11mls. Divida esse valor por três outras quantidades: o tempo do ensaio, que durou 10 minutos, o volume de enzima utilizada no ensaio, que foi variado (vamos usar 1ml), o volume de mililitros usado na detecção colorimétrica, o que pode diferem com base em seu cuvete. Nós usamos 2 mls. </li><li> Micromoles de tirosina dividida pelo tempo em minutos de medição rendimentos da atividade da protease chamado de &quot;unidades&quot;. Podemos cancelar as unidades de medição de volume no numerador e denominador, deixando um measurment da atividade enzimática em termos de unidades / ml. A fim de determinar a atividade em uma amostra sólida protease diluído em diluente enzima, dividimos a nossa actividade em unidades / ml pela concentração de sólidos utilizados neste ensaio originalmente em mg / ml., Deixando-nos com a atividade em termos de unidades / mg . Unidades / ml de enzima Unidades / mg sólida = _____________________ mg sólido / ml de enzima </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

Nós apenas mostramos como analisar a atividade da protease usando ensaio da Sigma atividade universal protease. Além disso, este ensaio é útil para garantir que nossos proteases têm precisamente determinada atividade antes de recebê-los para suas experiências. Como você viu, ao fazer este procedimento, é de fundamental importância para lembrar para aquecer tanto a caseína e soluções tirosina lentamente e não fervê-los. Além disso, é fundamental para preparar espaços diferentes para ambos os padrões do seu e para cada amostra de teste que você tem.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases, que é o que fazemos durante os nossos procedimentos de controle de qualidade. Neste ensaio, a caseína atua como um substrato. Quando a protease estamos testando digere caseína, o aminoácido tirosina é liberado junto com outros aminoácidos e fragmentos peptídicos. Reagente Folin e Ciocalteus Fenol, ou de Folin principalmente reage com tirosina livre para produzir um cromóforo de cor azul, que é quantificável e medida como um valor de absorbância no espectrofotômetro. Quanto mais tirosina que é liberado a partir de caseína, mais os cromóforos são geradas e mais forte é a atividade da protease. Valores de absorbância gerada pela atividade da protease são comparados a uma curva padrão, que é gerado pela reação de quantidades conhecidas de tirosina com o reagente FC para correlacionar mudanças na absorbância com a quantidade de tirosina em micromoles. Partir da curva padrão da atividade de protease amostras pode ser determinado em termos de unidades, que é a quantidade em micromoles de equivalentes de tirosina liberada a partir de caseína por minuto. Para ver este artigo em chinês, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">clique aqui</a>

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Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases.

Não-específicas da Sigma ensaio de atividade de protease - A caseína como substrato

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Bioquímica

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Pesquisa do câncer

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Um ensaio de clivagem de peptídeo Fluorogenic para triagem de atividade proteolítica: aplicações para coronavirus spike ativação de proteína

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biologia

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Imunologia e Infecção

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

Detecção direta de isolevuvolinas em tecidos usando uma proteína de fusão D11 scFv-fosfatase alcalina e imunofluorescência

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Não-específicas da Sigma ensaio de atividade de protease - A caseína como substrato

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