Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Резюме

Здесь мы показываем, цитоплазматические микроинъекции Xenopus laevis Ооцитов с ядерным субстратом импорта, а также подготовка ооцитов вводили для визуализации на тонких срезов электронной микроскопии.

Аннотация

Микроинъекции Xenopus laevis ооциты затем тонких срезов электронной микроскопии (ЭМ) является отличной системой для изучения nucleocytoplasmic транспорта. Из-за своего большого ядра и высокой плотности ядерного комплексов пор (НПС), перевозка ядерного материала может быть легко визуализированы в ооцитов Xenopus. Многое понимание механизмов ядерного импорта и экспорта был накоплен за счет использования этой системы (см. обзор Panté, 2006). Кроме того, мы использовали микроинъекции ооцитов Xenopus препарировать ядерной пути импорта из нескольких вирусов, которые воспроизводят в принимающей ядра.

Здесь мы показываем, микроинъекции цитоплазмы ооцитов Xenopus с ядерным субстратом импорта. Мы также показываем, подготовка ооцитов вводили для визуализации на тонких срезов EM, в том числе рассечение, обезвоживание, и вложение ооцитов в смоле вложение эпоксидной смолы. Наконец, мы предоставляем представителя результаты для ооцитов, которые были microinjected с капсида из бакуловирус Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) или вирусов парвовирус Минута Мыши (MVM), а также обсудить возможности применения техники.

протокол

Часть 1: Подготовка ооцитов Xenopus для микроинъекции

1. Место небольшой кусочек (около 2 см) яичников Xenopus laevis в 50-мл коническую трубку, содержащую 20 мл коллагеназы решения (5 мг / мл коллагеназы в кальции без солевых изменение Барта: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,82 мМ MgSO _4, 10 мМ HEPES, рН 7,5). Коллагеназа используется для удаления фолликула клетками, которые окружают ооцитов.
2. Поместите пробирку на платформе шейкера и рок-это мягко (при 100 оборотов в минуту) в течение одного часа. На этот раз меняется в зависимости от разных партий коллагеназы. Таким образом, после одного часа, взять небольшой образец ооцитов и рассмотреть их под микроскопом вскрытии. Правильно де-folliculated ооцитов должна быть хорошо отделены друг от друга, и она должна быть легкой, чтобы вставить стекло иглы в ооцит. Если ооцитов не являются достаточно де-folliculated, они остаются в коллагеназы решение и вновь проверяется каждые пять минут.
3. Вымойте ооцитов три раза физиологическим раствором изменение Барта (MBS: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,82 мМ MgSO _4, 0,33 мМ Ca (NO _{3) 2,} 0,41 мМ CaCl _2, 10 мМ HEPES, рН 7,5), и передавать их к 100-мм диаметра чашки Петри содержащие MBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина. Ооциты готов к microinjected. Если микроинъекции будут выполняться на другой день, хранить ооцитов при 4 ° С не более одной недели.
4. Использование рассекает микроскоп, выберите зрелой стадии VI ооцитов для микроинъекции. Эти ооциты большие, с хорошим контрастом между черным полушарии животного и сливочного цвета растительного полушарии.
5. Передача зрелых ооцитов VI этап в тарелку микролуночные (Nunc, 10 мкл и объема). Это должно быть сделано тщательно, используя 200-мкл пипетки с пипетки, разрезанные на конце, чтобы бесперебойное всасывания ооцитов.

Часть 2: Микроинъекция ооцитов Xenopus

1. Подготовка импорт субстрат microinjected путем добавления небольшого количества 1% бромфенол синий, для оказания помощи в визуализации микроинъекции. Например, мы добавляем 1 мкл бромфенол синего до 10 мкл субстрата.
2. Место небольшую полоску парафильмом на 100-мм блюдо диаметром Петри, и обойтись без 5-мкл каплю раствора для инъекций по парафильмом полосы.
3. Заполнить ранее калиброванный инъекционной иглой (полученные путем вытягивания 6,6 мкл микропипетки Драммонд с Inject + Matic Puller) с решением для инъекций. Для этого microinjector установлен на стремлении режима. Для калибровки инъекционной иглой делают точка знаки на иглу каждые 0,5 мм, что соответствует объемом 50 NL.
4. Для цитоплазматической инъекции, вставить кончик иглы в ооцит в вегетативного полушария, очень близко к животным полушарии, на примерно 45-градусный угол. Включите настройку microinjector к microinject и microinject каждого ооцита с 50 п импорта подложки. Точка знаки на иглы используются для мониторинга количества субстрата, который был вводили.
5. Передача вводят ооцитов в небольшой (35-мм в диаметре) чашки Петри заполнены MBS, и инкубируют при комнатной температуре в течение необходимого количества времени (временные точки выбираются так, чтобы наблюдение импорта подложки связанные с НПС; это происходит от 10 до 30 минут для белков и вирусов, которые активно транспортируются к NPC, на этот раз также зависит от места инъекции и размер белка / вируса).
6. При инкубации завершения передачи ооцитов в 4-мл стеклянный флакон, содержащий 2% глутаральдегида в MBS, и исправить течение ночи при 4 ° C.

Часть 3: Препарирование ооцитов Xenopus

1. На следующий день, мыть ооциты 3 раза с MBS.
2. Передача ооцитов в небольшой чашке Петри заполнены с низким буфера соли (LSB: 1 мМ KCl, 0,5 мМ MgCl _2, 10 мМ HEPES, рН 7,5). Использование рассекает микроскопа и рассекает пинцет, удалите вегетативного полюса друг от яйцеклетки. Это полезно для стабилизации ооцитов будучи расчлененным с одним пинцетом, а другая пара используется как ножницы для удаления растительного полюса. На этом этапе можно оценить успех микроинъекции наличием синий оттенок в цитозоле. Протокол продолжаться только в течение ооцитов, которые были microinjected успешно. Кроме того, если образцы должны быть готовы к Е. М., это рассечение шаг делает его гораздо проще найти ядра при обрезке и срезов образцов.
3. Fix расчлененный ооцитов снова с 2% глутаральдегида в LSB в течение одного часа при комнатной температуре.
4. После фиксации, мыть расчлененный ооцитов три раза с LSB.

Часть 4: Подготовка Injected ооцитов для вложения и тонких Секционирование EM

1. Передача расчлененный ооцитов к депрессии слайда. Аспирируйте столько жидкости, как позваны, а затем быстро (чтобы они не высыхают) охватывают расчлененный ооциты с 2% легкоплавких агарозы. Хотя агарозном еще мягкие, используйте пипетки на отдельные ооциты друг от друга, и обеспечить, чтобы каждый ооцит лицевой стороной вверх или вниз (а не вбок).
2. Разрешить агарозном закрепить в течение приблизительно 10 минут. После агарозном затвердевает, используйте лезвие, чтобы разрезать агарозы на мелкие кусочки, каждый из которых содержит один расчлененный яйцеклетки.
3. Место агарозном встраиваемый ооцитов в 4-мл стеклянный флакон, и после их исправить с 1% OsO ₄ в LSB в течение одного часа при комнатной температуре.
4. Промыть образец три раза в LSB. При необходимости, хранить образцы при температуре 4 ° С в течение ночи и продолжают протокола на следующий день.
5. Последовательно обезвоживают образцов в восходящей серии алкоголя (50, 70 и 90% этанола в течение 20 минут каждый). Далее следуют два изменения в 100%-ным этанолом в течение 15 минут каждый. Наконец обезвоживают образцы со 100%-ным ацетоном в течение 15 мин.
6. Проникнуть образцов смеси 1:1 Epon (Fluka) и ацетона в течение одного часа, после чего инфильтрат с 2:01 смесь Epon и ацетона в течение двух часов, и, наконец, в чистом Epon в течение не менее шести часов.
7. Место образцы в плоских форм вложения заполнены свежей чистой Epon. Ооцитов ориентированы таким образом, что стороны ядра ближе к инъекции - в этом случае стороны ооцитов, которые были расчлененные - будет секционного в первую очередь. Этот шаг оптимизирует возможность визуализации импорта выбраны подложки.
8. Наконец, полимеризуются Epon в течение двух дней при 60 ° C.
9. Для того чтобы представить образцы, блоки отделаны, а затем секционного использованием ультрамикротоме. Разделы переносятся на сетках Е.М., окрашенных с использованием стандартных процедур и визуализированы с просвечивающего электронного микроскопа. Мы не будем показывать это часть протокола, как это стандартная процедура EM.

Часть 5: Представитель Результаты:

Если протокол был успешным, то ядерная оболочка (NE) и НПС должны быть четко видны в ЭМ микрофотографии. В зависимости от введенного субстрата и количества времени между введением и фиксации, субстрат должен быть виден во цитоплазматических лицо NPC, в NPC, или, по крайней ядерной лица NPC.

На рисунке 1 показано Н. Е. сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которая была введена с капсиды из бакуловирус AcMNPV, инкубировали при 4 ° С в течение четырех часов, и обработанные для вложения и шлифе EM, как описано. Стрелки указывают на NPC. Капсида док на цитоплазматических лицо NPC указывает белая стрелка.

В отличие от этого, на рисунке 2 показано Н. Е. сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которые были введены с Вирус парвовирус Минута Мыши (MVM), выдерживают при комнатной температуре в течение четырех часов, и обработаны для вложения и тонкий срез EM, как описано. Используя эту технику, мы обнаружили, что MVM вызывает нарушения NE (Коэн и Panté, 2005). Скобки указывают на перерывы в NE. Стрелки указывают на NPC. Предполагаемые капсиды MVM связанные с Н. Е. обозначены белыми стрелками.

Рисунок 1: Электронная микрофотография NE сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которая была введена с капсиды из бакуловирус Ас MNPV, инкубировали при 4 ° С в течение четырех часов, и обрабатываемых в вложения и тонкий срез EM, как описано. Стрелки указывают на NPC. Капсиды обозначены белыми стрелками. Шкала бар: 100 нм.

Рисунок 2: Электронная микрофотография NE сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которые были введены с Вирус парвовирус Минута Мыши (MVM), выдерживают при комнатной температуре в течение четырех часов, и обработаны для вложения и тонкий срез EM, как описано. Стрелки указывают на NPC. Скобки указывают на перерывы в NE. Предполагаемые капсиды MVM связанные с Н. Е. обозначены белыми стрелками. Шкала бар: 100 нм.

Обсуждение

Микроинъекция ооцитов Xenopus в сочетании с тонкими секционирования EM является весьма эффективным инструментом для изучения nucleocytoplasmic транспорта. Эта система была использована для перевода различных шагов импорта через NPC, например, взаимодействие ядерных подложки импорта со струк...