Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Резюме

Этот протокол свидетельствует о том, как выполнить иммуногистохимии на расчлененный личинки дрозофилы.

Аннотация

протокол

Перед тем как начать

1. Подготовьте следующие решения: PBT (0,1% Triton X100 в 1X PBS), PBTB (0,2% BSA в PBT) и PBTN (2% в PBTB NGS).
2. Рассеките дрозофилы личинок. Пожалуйста, смотрите дрозофилы личинок NMJ Dissection.

Иммуногистохимия

1. Перемещение личинок 1,5 мл пробирку PBT. Вымойте личинки дважды за 15 минут в PBT. Примечание: для стирки, места 1,5 мл трубки на nutator смесителя. Удалите жидкость с pippetor и заменить его свежей жидкостью.
2. Удалить PBT. Стирать в PBTB два раза в течение 30 минут.
3. Удалить PBTB. Стирать в PBTN два раза в течение 15 минут.
4. Инкубируйте в первичных антител разводят в PBTN при комнатной температуре в течение 1 часа или при температуре 4 º С в течение ночи.
5. Промыть два раза PBTB. Примечание: для полоскания добавить раствор и удалите быстро.
6. Мыть два раза в течение 15 минут в PBTB.
7. Стирать в PBTN течение 30 минут.
8. Инкубируйте в вторичными антителами (и сопряженных первичных антител, если вы используете один) разводят в PBTN.
9. Крышка из фольги и инкубировать в течение 1,5 часа при комнатной температуре.
10. Промыть два раза PBTB.
11. Мыть два раза в течение 15 минут с PBTB.
12. Приступить к установке.

Монтаж

Примечание: Гора в глицерине, если образцы будут отображаемого сразу. Горы в Продли Золотой если образцы будут храниться до томографии (более недели), или если образцы должны быть отображены несколько раз. Для использования, место бутылку продлить на 65 ° С водяной бане в течение 2-3 минут. Возьмите аликвоту Продли золото и держать в на тепло-блок на 45-50 º C.

1. Налейте окрашенный подготавливает в PBT в к часовым стеклом.
2. Поместите немного глицерина на чистое предметное стекло для обработки.
3. Перемещение животных на обработку слайдов, выбирая их из часовым стеклом на углу использованием щипцов. Убедитесь, что они являются кутикулы стороной вниз.
4. Удалите головы и хвоста с новым лезвием на слайде обработки стекла. Exacto-нож с лезвием № 16 работает хорошо для этого.
5. С другой слайд (монтаж слайд), положить небольшую каплю глицерина / продлить и распространить ее чистой щипцами.
6. Перемещение расчлененный животных монтаж слайд их края, заботясь, чтобы не инвертировать их. Попробуйте подключить их в ряды в той же ориентации. Горы 6-8 животных на слайде.
7. Оставьте покровным стеклом, поставив на край в глицерин / Продли и медленно отпуская ее.
8. Печать слайдов с лаком для ногтей. Примечание [Не изображение, пока лак высохнет. Это обычно занимает десять минут. Для образцов установлены в продлении золото, слайды высохнуть в течение по крайней мере за три часа до запечатывания или изображений.]

Обсуждение

Иммуногистохимии (IHC) имеет жизненно важное значение для изучения NMJ биологии, поскольку она позволяет визуализировать NMJ. Это достигается с помощью антител, которые распознают нейронной мембраны (например, HRP), presynapse (например, CSP, SYT), и / или postsynapse (например, DLG). Сигнальных молекул, структ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000	Carl Zeiss, Inc.	495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD	Carl Zeiss, Inc.	000000-1063-181
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Adams™ Nutator Mixer	BD Biosciences	421105
No.1 Precision knife	X-Acto	3201
No. 16 Blades	X-Acto	216
ProLong Gold Antifade reagent	Invitrogen	36930