JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Обсуждение
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод выставляет neuromusculature дрозофилы эмбриональных для иммуногистохимии или электрофизиологические записи. Это полезно для изучения ранних событий в нервно-мышечной развития или при выполнении электрофизиологии в мутантов, которые не могут люк.

Аннотация

Дрозофилы является одним из ведущих генетических модель для изучения как эмбриональное развитие и функциональные нейронауки. Традиционно, эти поля достаточно изолированы друг от друга, причем в значительной степени независимых историй и научных сообществ. Тем не менее, взаимодействие между этими обычно разрозненных полей программ развития основных функциональных приобретение электрической сигнализации свойства и дифференциация функциональных синапсов химических во время финальной фазы нейронных формирование контура. Этот интерфейс является критически важной областью для исследований. У дрозофилы, эти фазы функционального развития происходят в течение периода <8 часов (при 25 ° С) в течение последней трети эмбриогенеза. Это поздний период развития, был долгое время считались неразрешимыми для расследования из-за отложения жесткой, непроницаемой эпидермальный кутикулы. Прорыв продвижение было применение воды полимеризации хирургического клея, которые могут быть применены к локально кутикулы чтобы контролируемые рассечение поздней стадии эмбрионов. С спинного продольного разреза, эмбрион может быть в горизонтальном положении, выставляя брюшной нервной и мускулатуры стенки тела в экспериментальном исследовании. Эта система была активно используется, чтобы изолировать и охарактеризовать генетических мутантов, которые препятствуют образованию эмбриональных синапса, и таким образом выявить молекулярные механизмы, регулирующие спецификации и дифференциации синапсов соединений и функциональных свойств синаптической сигнализации.

протокол

Часть 1: Оборудование и расходные материалы

  1. Хороший микроскоп вскрытия требуется для вскрытия эмбриона; 40-кратном увеличении предлагается, с 25X глаз части, чтобы максимально увеличить увеличения.
  2. Изобразительное щипцы (№ 5), необходимые для ручного выбора эмбрионов и devitellinization эмбрионов.
  3. Оборудование, чтобы сделать и изменить тонкие иглы окошком. Тянули-стекло игл, необходимых для вскрытия. Мы предпочитаем твердого стекла для вскрытия (дольше), но стандартные толстостенных стеклянных трубок (наружный диаметр 1-1,5 мм) тоже работает. Некоторые люди используют тонкие иглы вольфрама, электролизу с желаемой резкости в ванне с использованием 1М NaOH 10 + Amp автотрансформатора батареи. Заостренный иглы вольфрама вскрытии имеют преимущество, что они являются относительно устойчивыми и долговечными. Холлоу иглы стекла (образуются похож на патч зажим электродов) прикреплены к пластиковой трубки и используются во время вскрытия для всасывания и изгнания физиологического раствора, а также контролируемые поставки клея. Различные стеклянные съемники доступны для изготовления стекла иглы. Компьютер запрограммирован съемники могут быть предварительно вытащить разнообразие форм и размеров. Brown-Flaming моделей (Саттер машиностроительный завод) широко благоприятствования. Сложного микроскопа (20-40X цель) должны быть доступны для осмотра и изменить электроды перед использованием.
  4. Два типа решений обычно используются для ванн эмбриональных тканей при вскрытии: 1) «стандарт» (Ян и Ян, 1976а) или "изменение стандарта" (Broadie, 2000), солончаков, на основе решения, обычно используемые для записи на других беспозвоночных системы , и 2) "гемолимфы-как" (HL) солончаков (Стюарт и др. 1994), компромисс между стандартной солевой раствор и ионной концентрации измеряются в гемолимфы дрозофилы. Следует отметить, что ни один из этих солончаков точно имитировать химического состава гемолимфы в естественных условиях (Broadie, 2000). Стандартный солевой содержит (в мм): 135 NaCl, KCl 5, 4 2 MgCl, 1,8 CaCl 2, 72 сахарозы, 5 ТЭС, рН 7,2. Экспериментаторы также можете рассмотреть коммерчески подготовленные насекомых физиологического раствора (например, Шнайдер насекомых Media), который не подходит для электрофизиологических записи, но, скорее всего, для защиты здоровья облученных тканях.

Часть 2: Постановка эмбрионов и Dissection

  1. Для оптимального сбор яиц, поддерживать молодых (<7 дней), здоровых мужчин и женщин мухи (20-40) на свежем прокладки горшках в течение 2-3 дней. Укладка горшки обычно состоят из 100 мл пластиковые стаканы (Tri-Pour) перфорированные обеспечить достаточную циркуляцию воздуха, охватывающие 60 мм агар пластины. Агар пластины содержат яблочный или виноградный сок закаленные с агара. Несколько рецептов существует, но один пример выглядит следующим образом: 700 мл воды, 25-30 грамм агара, 300 мл концентрата сока (виноградного или яблочного), 0,5 г метилпарабен (р-hydroxymethylbenzoate) и 30 г сахара. Автоклав воды и агар, и отдельно кипения р-hydroxymethylbenzoate с сахаром и соком. Смешайте сок агар и решения и быстро вылейте на 60 мм пластинами, удаляя пузырьки.
  2. До сбора яиц, мухи питаются дрожжи пасты (7 граммов дрожжей в 9 мл воды, хранить при температуре 4 ° С) на свежих пластинок, менять не реже двух раз в день в течение по крайней мере два дня. Днем 3, хороший горшок должен производить 100-200 яиц в час. Лучше откладки яиц наблюдается на горшок поддерживаться на боку с агара в пластине поцарапан. Многие эмбрионы будут проложены внутри или рядом с царапинами.
  3. Для сбора большого количества эмбрионов, мягко передачи эмбрионов из агар пластины в корзину помощью кисти. Корзина может быть сделано с 15 или 50 мл центрифужную пробирку. Отрежьте нижнюю оставляя достаточно площади поверхности для улавливания экрана (70 мкм сетки) между крышкой и верхней части трубки. Промыть эмбрионы с дН 2 0 и положить в чашку Петри свежей 50% до 100% отбеливатель для удаления внешней хориона. Кроме того, яйца можно подбирать индивидуально с использованием тонких щипцов, и dechorionated, размещая их вручную в каплю отбеливателя. Де-chorionation может занять от 30 секунд до 2 минут (свежие отбеливателя намного быстрее), а также должны быть проверены в соответствии рассечение микроскопом. Удаление хориона раскрывает блестящие, прозрачные желточной оболочки. Dechorionated яйца должны быть кратко промыть, либо помещены в физиологическом растворе, как отбеливатель быстро разрушает devitellinized тканей.
  4. Очень важно тщательно стадии эмбрионы желаемого развития, возраста. Определены дрозофилы эмбриональной стадии (1-17; Кампос-Ортега и Хартенштайн, 1985) не являются полезными, так как все функциональные нервно-мышечной развитие происходит в конце 16 этап или этап 17. Таким образом, эмбрионы в постановке развития часов при 25 ° С в увлажненной инкубатор, в часы после оплодотворения, или, чаще, после откладки яиц (AEL). В этих условиях эмбриогенеза длится 21 + / - 1 час при 25 ° C.
  5. Яйца из приурочен яйца лежали (1-2 чы), которые надлежащим возрасте находятся рядом рассматриваться для морфологических критериев. После продолжительного мытья в дН 2 O, dechorionated яйца помещаются в пластиковый блюдо культуры (под дН 2 O) для просмотра. Правильная постановка может быть подтверждено с морфологическим критериям использования отраженного света с рассечение микроскоп (Кампос-Ортега и Хартенштайн, 1985). Зрелые поздней стадии эмбрионов (22-24h AEL) на грани штриховки, как правило, признаются сегментации кутикулу и завышенные трахеи. Эмбрионы могут быть генотипировали использованием GFP балансиры и флуоресцентного микроскопа рассечение с соответствующими фильтрами.
  6. Для вскрытия, dechorionated и умственно поставил эмбрионов прилагаются (спинной стороной вверх) на покровное по капле физиологического раствора (см. шаг 1.5). Эмбрионы будут удалены из желточной оболочки путем прокола мембраны возле переднего или заднего конца с микропипетки стекла или вольфрамовой иглой, а затем осторожно освобождая эмбриона от мембраны. В ходе подготовки к диссекции, эмбрион должен быть расположен на покровное с спинной до поверхности (спинной стороны до вскрытия выставят вентральной нервной системы и neuromusculature для экспериментов. Однако эмбрион очевидно, может быть расположен и в других отношениях для облегчения доступа к другим ткани.)
  7. Ранние стадии эмбрионов (<16 часов AEL) крепятся непосредственно для очистки стекла или стекла с покрытием полилизином (поли-L-лизин гидробромид; Broadie и БАТЭ, 1993а, б). Старые эмбрионов (> 16 часов AEL), после кутикулы образования, должны быть приклеены, в идеале, чтобы Sylgard покрытием (Dow Corning) покровные. Воды полимеризации цианоакрилат хирургических или ветеринарных клей используется (Broadie и БАТЭ, 1993c, г). Клей поставляется через небольшой пипеткой стеклянный электрод (10-20 мкм внутренний диаметр кончика), подключенных к резиновой трубкой с клеем поток контролируется рот давления. Необходимо соблюдать осторожность во время клей доставки, а клей полимеризуется быстро после контакта с раствором. Отметим также, что склеивание не может быть выполнена в физиологическом растворе с отсутствием или низкой концентрации ионов двухвалентного, так как клей требует двухвалентных ионов к полимеризации. Небольшое количество клея первом использовании твердо приложить голову и хвост.
  8. Как только концы эмбриона приклеены к покровным, надрез вдоль спинной средней линии с электродом стекла или заостренным вольфрамовой иглы. Это стало легче, осторожно перфорационные линии разреза до принятия окончательного монтажа. Стороны разреза затем прикрепляется к покровным с более клей, чтобы мягко распространению эмбриона квартиры. Внутренние органы, включая кишечник, жир тела и, опционально, трахеи затем удаляются путем всасывания с помощью стеклянной пипетки прилагается к резиновой трубки (Broadie и Бейт 1993а-в). Эмбрион должен теперь быть прикреплены к плоской покровное, эпидермис вниз с вентральной центральной нервной системы, периферических нервов, и соматической мускулатуры подвергается для экспериментов.

Обсуждение

Точная постановка эмбрионов является критическим из-за быстрого созревания функциональных свойств с течением времени хода всего несколько часов. Несколько вопросов, усложняют эту постановку. Во-первых, большинство исследователей использовать приурочен яйца откладывает на стадии эм...

Благодарности

КБ поддерживается NIH грант GM54544.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Embryo Collection CagesGenesee Scientific59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video
Sylgard 184Dow CorningAvailable from various companiesSurgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mmVariousFor pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue applicationTygonTubing inner diameter needs to match glass outer diameter.

Ссылки

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A., Bate, M., Martinez Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. i. t. t. l. e. t. o. n., Broadie, K., MA, B. h. a. t., Harbecke, R., JA, L. e. n. g. y. e. l., Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. r. a. n. d. Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. , 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. e. o. n. a. r. d. o. a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Martinez Arias, A. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. v. a. n. d. e., Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3. r. d., Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP.. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience27

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены