В естественных условиях Са 2 + - Съемка Гриб Нейроны тела во время обучения в обонятельной Honey Bee

Резюме

Пчелы могут быть обусловлены в аппетит обонятельных парадигмы обучения (PER кондиционирования). Использование запахов в качестве стимула, мы создали метод, в котором поведение записывается одновременно Кальций изображений используется для измерения запаха вызванную активность нейронов в грибном теле В естественных условиях.

Аннотация

В естественных и полу-в естественных условиях подготовки к Кальций изображений был разработан в нашей лаборатории по Joerges, Каттнер и Galizia более десяти лет назад, для измерения запаха вызванной активности в усиков доли ^1. С тех пор она постоянно изысканный и применительно к различным neuropiles у пчелы мозга. Здесь мы описываем подготовки в настоящее время используется в лаборатории для измерения активности нейронов в грибном тела с помощью декстран связан кальций-чувствительных красителя (Фура-2). Мы ретроградно пятно гриб нейронов тело путем введения красителя в их аксонов и сомы регионе. Мы делаем ставку на снижение инвазивности, для достижения подготовки, в которых он по-прежнему можно обучить пчел использованием PER кондиционирования. Мы в состоянии контролировать и количественно поведенческой реакции при записи электро-myograms из мышц, которая контролирует PER (М17) ^2.

После физиологического эксперимента отображаемого структур исследованы более подробно с помощью конфокальной сканирующей микроскопии для решения личность нейронов.

протокол

Би Подготовка и Back-заполнить

1. Поймать фуражиров пчелиный мед в улей и охладить на льду для иммобилизации.
2. Горы в оргстекла записи камер ^3. Fix глаза и грудная клетка со стенками камеры записи с низкой температурой плавления твердым воском.
3. Вытяните стеклянных капилляров, как обычно используются для электрофизиологии и ломать на кончике получить наконечник диаметром ок. 10 мкм. Обложка кончика капилляра с красителем пасты. Dye паста состоит из смеси 10:01 Фура-2 декстран и лизин поправимо tetramethylrhodamine декстран.
4. Для окрашивания процедуры иммобилизации антенн с мелочами или н-эйкозана. Удалите часть кутикулы выше мозга и нажмите железы и трахеи в сторону, чтобы разрешить доступ к телу гриба.
5. Inject капилляров в любом сомы или аксонального области грибами нейронов тела. Это можно сделать свободной рукой или с помощью микро-манипулятором. Затем восстановление кутикулы часть на головной капсулы и ослабить антенн.
6. Поток пчел с 30% раствором сахарозы перед сохранением их в увлажненные случае, по крайней мере четыре часа или в течение ночи при 20 ° C.

В естественных изображений

1. Предотвращение движений пчелы, например, с небольшой кусочек губки, которые прижимают живот и закрепляется клип или ленты с записью камеры.
2. Для предотвращения движения мозга в результате перекачки пищевода, вырезать небольшой разрез в кутикулу выше губы и вытяните тщательно пищевода и окружающих его структур твердых поставить его под напряжением без повреждения пищевода ^4. Крышка с двухкомпонентный силикон.
3. Проделайте отверстия с иглой и вставить провод электроды для записи М17.
4. Удаление кутикулы кусок, трахеи и железы выше мозга. Соси heamolymph внутри головной капсулы с лист бумаги.
5. Заполните головной капсулы с двухкомпонентной силикона. Важно, что мозг полностью закрыта.
6. Место Пчела на столик микроскопа и поместить каплю воды на поверхности силиконовых погрузить падение цель микроскопом в капле. Сосредоточьтесь на окрашенных нейронов.

Запах стимуляции и регистрации сигналов

Ольфактометра: Мы используем компьютерным управлением, пользовательские построили устройство стимуляции или "ольфактометра", как описано ранее Galizia и Веттер ^3. Запахи разводят в постоянный поток воздуха направлен антенн. Любой стимул состоит из импульса 3s запах 0,2 мл насыщенного запахом воздух. Стимуляции протокол может быть установлен в TILLVision записи программного обеспечения.
Микроскоп и работы с изображениями настройки: Мы используем Zeiss флуоресцентного микроскопа. Изображения записываются при 25 ° С, отбор проб, размере 5 Гц использованием ДО-Photonics изображений устройство, смонтированное на микроскоп. Кальций сигналы записываются через X60, 0,9 Вт Olympus падения объектива с Imago CCD камера (640х480 пикселей, 4х binned на чипе до 160х120 пикселей). Фура-2 возбуждается монохроматическим светом в 340 и 380 нм длины волны для логометрических измерений. Флуоресценции обнаружена через 410nm дихроичных зеркал и 440nm долго фильтра. Параметры записи настраиваются в программное обеспечение для записи. Каждое измерение длится 10 секунд, а время экспозиции для двух длин волн может быть настроен на интенсивность окрашивания в каждом препарате.
M17 записи: транспортир мышцы губы (M17) записывается внеклеточно контролировать поведенческие реакции связаны с обучением, то есть за ^{5, 6.} Inject медной проволоки в мышцу близко ко рту частей. Inject боковом электроде в глаз. Потенциалов мышц усиливаются с пользовательским построить предварительный усилитель, оцифрованы и хранятся на компьютере. Стимул начала вызван ольфактометра.

Анализ данных

1. Во время эксперимента: записи кальциевый сигнал подается в компьютер и сохраняются. TILLVision записи программное обеспечение позволяет первоначальной проверки из сигналов, как и расчет соотношения между длиной волны (340nm/380nm) и расчет deltaF (вычитание базовых).
2. Обработка изображений осуществляется с помощью пользовательских написанные программы в IDL. Рассчитайте соотношение Са ^{2 +} сигналы от 340 нм и 380 нм измерений для каждого пикселя. Определите фоновой флуоресценции (F) путем усреднения по кадров перед стимулом и вычесть из логометрических сигнала (deltaF).
3. Чтобы определить области интереса (ROI): Вычислить среднее кадров при стимулом и применить фильтр нижних частот (3X3px). Преобразование серого к ложным цветовой гамме. Определение активности в нейронных структурах, как деятельность пятна в ложных цветных изображений и определить, как ROI.
4. Рассчитать временной динамики активных областей путем усреднения пикселей в ROI за все кадры без какой-либо фильтрации или коррекции.

Морфологический анализ и реконструкция

Вместе с Фура-2 декстран мы заполняем нейронов с поправимо красителя родамина декстрана («мини рубин"). Оба красители имеют одинаковую молекулярную массу, они должны размещаться в нейронах. Широкие поля изображения позволяет лишь весьма ограниченные пространственным разрешением, поэтому рекомендуется исследовать окрашенных структур после эксперимента с помощью конфокальной сканирующей микроскопии.

1. После физиологических измерений, препарировать мозг и зафиксировать.
2. Полоскание в PBS и ступенчатого обезвоживают в этаноле и ясно в метил салицилат.
3. Для конфокальной микроскопии вставлять мозга в салицилат метиловый.
4. Мы используем Leica TCS SP2 микроскопом. Возбуждение длина волны 543nm.
5. Мы сканирования мозга с воздуха или цель погружения нефти и сравнить окрашенных структур с изображениями данных.

Представитель Результаты:

Если окрашивание и подготовка прошла успешно, ложный сигнал в цветовой гамме, например, в грибном теле альфа доли внешних нейронов, может выглядеть на рисунке 1.
Поведенческая реакция (PER) может быть рассчитана как частота шип во время стимулом минус шип частоту перед стимул (figure2).
Окрашенных структур могут быть исследованы более подробно использованием конфокальной микроскопии (рис. 3).

Рисунок 1: представитель Кальций изображений сигналов (стимуляция heptanal). : Отображаемого области пчелы мозга. B: Сырье флуоресцентные изображения, наблюдаемый через X20 падение цели на длине волны 380 нм возбуждение, альфа-доли гриб тело, изложенные в фиолетовый. Dye вводили в вентро-латеральный край альфа-долями для окрашивания внешних нейронов. C: Ложные цветного изображения происходит от среднего сигнала, deltaF (340/380), в течение трех второй стимул, альфа-лепесток, изложенные в фиолетовый, выбранных ROI, изложенные в черный цвет. D: Временная динамика кальциевый сигнал в ответ на стимуляцию запах, средний сигнал от интересующей нас области, как указано в С. Е: Временная динамика кальциевый сигнал в ответ на стимуляцию сахарозы ипси-и противопоказания боковые антенны, соответственно, рентабельности инвестиций указано в C.

Рисунок 2: Представитель M17 ответ. После обонятельных кондиционирования пчелы расширяет хоботок, когда запах представлен без награды. Красная линия показывает запах стимул. Врезка: PER медоносной пчелы.

Рисунок 3: Представитель стек изображения. После визуализации эксперимента мозг расчленены. Нейрон из рисунка 1, отсканированный с помощью конфокальной микроскопии с погружением X20 нефти цель, альфа-доли, изложенные в фиолетовый.

Обсуждение

В этой презентации мы прошли через все шаги для расследования в естественных сигналов кальция в медоносной пчелы. Мы применили этот метод для грибов нейронов тела, но изображение может быть сделано на всех нейронов, для которых техника окрашивания может быть установлено. Мы сосре?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
low melting point hard wax Deiberit 502	Dr. Böhme Schöps Dental GmbH
FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW	Invitrogen	F-3029	Protect from light.
tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW	Invitrogen	D-3312	Protect from light.
n-eicosane	Sigma-Aldrich	21, 927-4
Kwik Sil Adhesive	World Precision Instruments, Inc.	KWIK SIL
Imaging Set-up	TILL Photonics
CCD camera	Imago
CED	Texas Instruments